Eph受体酪氨酸激酶A2和金属蛋白酶2在大肠癌组织的表达及其与大肠癌发生发展的关系

高其宏

(芜湖市第二人民医院胃肠外科，安徽 芜湖 241000)

大肠癌在临床上是一种常见的肠道恶性肿瘤，且近年来发病率有着逐渐增高的趋势。手术切除和术后的放、化疗及综合免疫治疗等，是大肠癌当前最主流的也是最有效的治疗方法。对于早期大肠癌手术切除后，治疗效果明显，生存期明显延长，但对于中晚期大肠癌术后出现转移及复发的概率明显增加。肿瘤转移的途径主要有淋巴结转移，血运转移及局部侵袭、浸润转移等[1]。Eph受体酪氨酸激酶A2(erythropoietin-produceing hepatocellular A2，EphA2)是促进新生血管形成最主要的因子，在肿瘤发生发展中起着重要的促进作用[2]。而金属蛋白酶-2(MMP-2)作为金属蛋白酶(MMPs)家族重要成员之一，本身是一种明胶酶，它的主要作用就是破肿瘤细胞周围的基质和基膜，从而使肿瘤细胞能够更容易的进行侵袭和转移[3]。关于EphA2和MMP-2在大肠癌的发生发展中到底扮演何种角色，研究的不甚清楚。本文通过免疫组织化学法联合检测EphA2蛋白和MMP-2蛋白在大肠癌及癌旁组织中的表达，探讨其在大肠癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1．1 标本及分组

(1)大肠癌组织：选取芜湖市第二人民医院2011年1月—2016年12月大肠癌手术切除后石蜡包埋标本76例，其中男性患者44例，女性患者32例，年龄区间为34～82岁，中位年龄57．6岁。且要求所有患者术前均未接受对于肿瘤的针对性治疗。其中高分化(包括高级别上皮类瘤变)癌3例，中分化癌45例，低分化(包括黏液腺癌、印戒细胞癌)癌28例。有无淋巴结转移51/25例。

(2)癌旁组织：在相应的76例大肠癌标本中，取距肿瘤3 cm以上病理检查未受到肿瘤侵犯的大肠组织。

1．2 试剂

MMP-2为鼠抗人单克隆抗体，EphA2为兔抗人多克隆抗体，两者均购自北京中杉金桥生物工程有限公司；枸橼酸缓冲液及DAB显色剂均购自福州迈新生物制剂有限公司；双氧水、微波炉等均来自本院病理科。

1．3 试验方法

将选中蜡块按4 mm间距连续切片，切片常规进行HE染色和免疫组化染色，光镜下观察。免疫组织化学法主要分为几步：(1)双氧水行内源酶灭活，(2)抗原修复液修复抗原，(3)滴加一抗，(4)滴加二抗，(5)滴加链霉素抗生物素过氧化物酶，(6) DAB显色，(7)苏木素复染，(8)脱水/透明/封片，显微镜观察。

1．4 结果判断

EphA2和MMP-2蛋白免疫组化阳性表达均是在细胞质内出现棕黄色染色。用半定积分法(即染色强度得分与阳性细胞百分率得分之和)判断两者表达强度。染色强度的评分标准：胞质未着色为0分，着淡黄色为1分，中等黄色为2分，深黄及褐色为3分。阳性细胞百分率的评判标准：随机选取5个不重复高倍镜视野，通过计算每个视野100个细胞中阳性细胞所占比例，得出此切片的平均阳性细胞百分率。平均阳性细胞百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～49%为2分，>49%为3分。两项得分之和，0～1分为(-)，2分为(+)，3～4分为(++)，5～6分为(+++)，2～6分均表示为阳性。

1．5 统计学方法

应用SPSS21．0统计软件分析包近代数据分析。观测数据主要为计数资料，其中部分为等级数据，其它均为两分类数据，故组间比较统一采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 EphA2和MMP-2在大肠癌、癌旁组织中的表达情况

大肠癌组织中EphA2蛋白表达阳性率为92.10%(70/76)，显著高于癌旁组织26．31%(20/76)、(P<0.05)。其中，EphA2中度阳性表达率和强阳性表达率分别为27.63%(21/76)及25%(19/76)，均显著高于癌旁组织的表达率(7.89%)、(5.26%)，见图1、图2。MMP-2在大肠癌组织中阳性表达率为80.20%(61/76)，同样显著高于癌旁组织15．90%(12/76)，(P<0.05)；其中大肠癌组织中中度阳性表达率和强阳性表达率分别为13.16%(10/76)、25%(19/76)，均显著高于癌旁组织的中度阳性及强阳性表达率(2.6%，2.6%)，见图3、图4。

2．2 EphA2与MMP-2的表达与临床病理特征的关系

大肠癌组织中的EphA2蛋白的表达强度较高，且EphA2蛋白表达水平与大肠癌组织分化程度、Dukes分期、淋巴结转移、年龄多有密切关联(部分比较为P<0.05)；MMP-2蛋白在大肠癌组织中同样呈高表达，其表达情况与大肠癌组织学分化程度、Dukes分期、淋巴结转移、年龄也有较密切的关联(部分比较为P<0.05)，见表1、表2。

3 讨论

肿瘤组织发生、发展有赖于新生血管的形成为其提供营养，EphA2是Eph家族中EphA亚家族的一个成员，是促进新生血管形成最主要的因子之一。有研究显示EphA2通过血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)模式，促进肿瘤毛细血管网不断壮大，从而参与肿瘤的生长过程[4]。有研究显示组织中EphA2表达程度与毛细血管的形成呈正相关，而肿瘤组织只要大于1 mm就会有毛细血管形成，因此EphA2在很多实体肿瘤中呈高表达状态。

表1 两种组织中EphA2和MMP-2的表达情况及比较/例

表2 大肠癌中EphA2和MMP-2的表达与各临床病理特征之间的关系/例

有观点认为EphA2调节血管生成的机制主要是通过与其配体EphrinA1的结合影响肿瘤血管内皮细胞的迁移，并通过影响细胞骨架，基质黏附和细胞黏附。从而促进组织和内皮细胞形成毛细血管样结构的形成、调控血管生成[5]。由此可见EphA2主要是通过促进肿瘤新生血管形成来参与恶性肿瘤的发生发展。局部浸润及淋巴转移、血性转移是恶性肿瘤复发及远处转移的主要方式，它们直接影响着患者的预后，而肿瘤新生血管的形成直接参与了上述三大过程，因此必然是肿瘤发生、发展的重要一环[6]。本研究表明，EphA2蛋白在大肠癌组织中表达水平显著高于癌旁组织 (P<0.001)，且与大肠癌的Dukes分期明显相关(P<0.05)，依此结果推断EphA2可能在Dukes分期较晚的肠癌患者中促进了大肠癌新生血管的形成，进而导致了大肠癌的发展，并且影响大肠癌出现淋巴结转移。

MMPs是一个含有9种酶蛋白分子的家族，它们主要通过破坏肿瘤组织周围细胞基质和基底膜，从而使肿瘤细胞进行更加容易的在局部进行浸润转移[7]。细胞基质和基底膜的主要构成蛋白则是Ⅳ型胶原和层黏连蛋白，而MMP-2本身是一种明胶酶，它是降解Ⅳ型胶原三螺旋结构的主要蛋白酶，因此它可能就肿瘤局部浸润的始动因素[8]。近年来不断有研究显示MMP-2在一些肿瘤的局部浸润转移中发挥着相当重要的作用[9]。本研究表明，大肠癌中MMP-2的表达水平明显高于癌旁组织(P<0．001)。且与大肠癌组织学分化程度、淋巴结转移明显相关(P<0.05)。依此结果推断MMP-2可能在组织分化程度不佳的病人中参与了大肠癌的侵袭、浸润，并较早较快的出现淋巴结转移，最终导致了大肠癌Dukes分期变晚，预后变差。

EphA2及MMP-2在大肠癌的发生发展中均可能起到了积极地促进作用，因此在临床上我们可以考虑通过联合检测EphA2、 MMP-2表达水平来判断大肠癌的恶性程度，以及预判患者的预后情况。另外我们也可以通过研究EphA2和MMP-2的作用机制，使它们成为靶向治疗的新方向。另外两者之间是否存在相互促进的因素，从而加快了大肠癌的进程，它们是否还有其它的作用机制未被我们发现，值得我们去进一步研究。

(本文图1～4见插图5-2)

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