卡纳琳肝癌热疗疗效的研究

曾广富, 唐小海*, 黄源芳, 张雪梅

(1. 四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101; 2. 重庆莱美药业股份有限公司, 重庆 401336)

热疗是通过吸热材料吸收光能将其转换成热能,利用局部升温杀死肿瘤达到治疗恶性肿瘤的新型方法[1-2],是肿瘤治疗中一种被广泛研究的技术[3-5].该方法是针对肿瘤部位的治疗,可以避免对其他组织造成损伤[6].

近红外光(NIR)对生物组织无损害且具有一定的穿透力,可以作为热疗的重要光源[7],但是单纯近红外光的热能远远不够达到治疗肿瘤的效果.因此各种光能的转换功能性材料应运而生,例如金纳米颗粒[8-10]、纳米碳管[11-12]和磁性纳米粒子[13]等.这些新颖的纳米材料因其独特的近红外光吸收性和光稳定性,被迅速地开发和利用于热疗.纳米碳作为热疗材料用于肿瘤治疗得到较好的疗效且无毒副作用[14].

光吸收纳米材料卡纳琳(CNSI)是以纳米碳为原料制备的纳米碳混悬注射液,颗粒直径约为180 nm,具有高度的淋巴系统趋向性.CNSI作为中国唯一批准上市的淋巴结示踪剂,在肿瘤研究应用以及临床使用中[15-17],也有大量研究将其作为抗癌药物载体[18-19].本文研究CNSI对肝癌模型作为吸热材料的体外及体内的热疗疗效.

1 材料和方法

1.1药品试剂、仪器与细胞株药品试剂:DMEM高糖培养基、青霉素链霉素溶液、PBS缓冲液、新生小牛血清(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)、CNSI(重庆莱美药业股份有限公司).

仪器:生物倒置显微镜(上海光学仪器厂)、培养箱(SANYO)、离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、超净工作台(苏净安泰)、水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)、近红外激光热疗仪.细胞株与动物:HepG-2(四川大学生物治疗国家重点实验室惠赠)、KM小鼠(成都达硕生物科技有限公司).

1.2方法

1.2.1细胞计数法检测CNSI体外热疗抗肿瘤活性 取对数生长期的HepG-2肝癌细胞制成单细胞悬液.根据细胞计数的结果调整细胞浓度,取24个玻璃培养皿,每瓶加入1 mL(约3×104个细胞)放入37 ℃、体积分数为5%的 CO2孵箱.隔日加入用培养基稀释的CNSI溶液(按培养基总体积将CNSI质量分数稀释至50 μg/mL).

将实验分为8组,分别为:对照组无处理,CNSI组加入50 μg/mL的CNSI,NIR组在1 W/cm2的NIR条件下连续照射3 d,每次3 min,实验组(CNSI+NIR 0.2 W/cm2、CNSI+NIR 0.4 W/cm2、CNSI+NIR 0.6 W/cm2、CNSI+NIR 0.8 W/cm2、CNSI+NIR 1 W/cm2)加入50 μg/mL的CNSI ,连续照射3 d,每次3 min.NIR照射前加入CNSI溶液,实验完成后用红外热像仪测量温度.每次照射完成后更换培养基,最后一次照射后继续培养2 d,用胰蛋白酶消化后计数,并计算

1.2.2CNSI体内热疗抗肿瘤活性 将KM小鼠32只随机分为4组,小鼠右前腿部接种HepG-2肝癌细胞(2×106个/只),待肿瘤体积约100 mm3时进行治疗.对照组无处理,CNSI组在肿瘤部位注射50 μL CNSI,NIR组在0.8 W/cm2的NIR条件下连续照射3 d,每次3 min,CNSI+NIR组在肿瘤部位注射50 μL CNSI,NIR为0.8 W/cm2的条件下连续照射3 d,每次3 min.

第一次治疗完成24 h后,每组取一只小鼠,将肿瘤部位取出做病理切片.观察、记录小鼠肿瘤生长情况,每2～3 d用游标卡尺测量一次肿瘤体积.测量方式为按直角测量肿瘤的长轴a和短轴b,计算肿瘤体积为

V=ab2/2.

小鼠饲养条件均为温度25 ℃、湿度60%、SPF级(无特定病原体),实验过程均遵从实验动物饲养管理条例及使用指南.实验数据采用SPSS 22进行统计,以均数±标准差(X±S)表示.

2 结果与讨论

2.1细胞层面的抑制作用NIR照射时细胞温度上升不明显,对细胞生长几乎无影响.CNSI组也对细胞生长无影响.实验组抑制率是随着功率的升高而升高,CNSI+NIR 0.2 W/cm2抑制率为25.45%,CNSI+NIR 0.4 W/cm2抑制率为46.72%,CNSI+NIR 0.6 W/cm2抑制率为76.43%,CNSI+NIR 0.8 W/cm2抑制率为99.02%,CNSI+NIR 1 W/cm2抑制率为99.75%(如图1).由此可以看出实验组NIR条件为0.8 W/cm2时达到较为理想的治疗效果.

图 1 不同NIR功率细胞热疗结果

2.2体内抑制作用从病例图片看出CNSI+NIR组肿瘤细胞大面积死亡达到预期治疗效果(图2(a)),NIR组对肿瘤细胞有一定的杀伤作用(图2(b)),空白组与CNSI组肿瘤生长较好(图2(c)和(d)).

CNSI对小鼠肿瘤的生长无影响,NIR组对肿瘤的抑制作用不明显,而CNSI+NIR组对肿瘤生长有显著抑制效果.

3次治疗完成后,从肿瘤生长体积曲线(图3(a))可以看出空白对照与CNSI组肿瘤生长趋势基本一致,CNSI对肿瘤的整个治疗过程均无影响;单NIR组前期有较小的抑制作用,但最后肿瘤仍然继续生长且与空白组几乎一致;CNSI+NIR组照射后肿瘤停止生长且30 d后仍未复发.空白组、CNSI组和NIR组小鼠肿瘤均无结痂, CNSI+NIR组小鼠治疗10 d后肿瘤开始结痂,20 d后结痂脱落(图

(a)近红外+卡纳琳

(b)近红外

(c)对照

(d)卡纳琳

图2肿瘤组织病例切片图

Fig.2Tumortissuecaseslice

3(b)).结痂证明了CNSI能够吸收光能并将其迅速转换为热能,达到局部升温的作用,从而杀死肿瘤细胞,而CNSI的示踪性将其分散于整个肿瘤,使得肿瘤被全方位治疗,肿瘤细胞死亡后形成结痂,然后逐渐脱落达到治疗的作用.

3 结论

研究表明恶性肿瘤比正常细胞更易受热刺激诱导细胞损伤和凋亡[20].功能性纳米材料作为热疗的热能转换器备受广大研究者的关注[14].

本研究选择的CNSI具有光稳定性、结构均一以及良好的淋巴结示踪性,注射到组织内的CNSI不进入血管,可迅速进入淋巴管或被巨噬细胞吞噬后进入毛细淋巴管,滞留、聚集在淋巴结,使淋巴结黑染,因此CNSI能够有效聚集在肿瘤部位,其主要成分纳米炭是良好的吸热材料.

肿瘤部位注射CNSI后,在NIR为0.8 W/cm2的条件下治疗小鼠肝癌模型,对各组的治疗效果进行统计,结果显示:CNSI+NIR(0.8 W/cm2)组具有显著的抗肿瘤效果,可以明显抑制肿瘤生长.CNSI作为光吸收纳米材料,具有光稳定性强、近红外特征吸收等显著优点,可以有效地应用于肿瘤光热治疗方面.

图 3 CNSI体内热疗示意图

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