2016～2017年嘉兴一院结核分枝杆菌耐药情况及其耐药机制研究

袁亚芳 潘稚芬

[摘要] 目的 了解嘉兴一院2016～2017年结核分枝杆菌耐药状况，并利用比较蛋白质组学研究其可能存在的耐药机制，为耐药结核病的防控策略提供科学依据。 方法 对2016年1月～2017年6月嘉兴一院746株结核分枝杆菌进行培养及药敏试验分析，采用双向电泳技术比较临床不同耐药菌株与敏感菌株的全菌蛋白表达图谱，利用基质辅助激光解吸及电离飞行时间质谱仪进行质谱分析，通过蛋白质数据库对差异表达蛋白质相应的基因进行序列分析。 结果 746株结核分枝杆菌中总耐药率为18.50%（138/746），單耐药率为9.92%（74/746），耐多药率为4.42%（33/746），多耐药率为4.16%（31/746）。4种药物的耐药率由高到底依次为异烟肼（INH，11.53%，86/746）、链霉素（Sm，10.86%，81/746）、利福平（RFP，5.36%，40/746）、乙胺丁醇（EMB，4.29%，32/746）。初治耐药率及复治耐药率分别为17.22%（115/668）、29.49%（23/78），复治耐药率高于初治（χ2=6.976，P<0.01）；从蛋白质组学功能分析结核分枝杆菌可能存在的耐药机制，发现了21个耐药结核杆菌的差异表达蛋白，其中5个蛋白的检出率在耐药菌株中相对较高，质谱分析获得明确的肽质量指纹图谱，分别为Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c。 结论 嘉兴一院近2年结核分枝杆菌耐药率保持在较低水平，且发现Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c与其耐药机制密切相关。

[关键词] 结核分枝杆菌；耐药谱；比较蛋白质组学；耐药机制

[中图分类号] R52 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）07-0071-05

[Abstract] Objective To investigate the status of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis（Mtb） and drug resistance related proteins， providing the basis for drug-resistant MTB prevention and control. Methods A total of 746 Mtb strains between January 2016 and June 2017 were cultured and anti-tuber-colosis drug susceptibility tests， the drug resistance of 4 kinds of anti-tuberculosis drugs was analyzed. The proteins extracted from different clinical drug resistant Mtb strains and susceptible Mtb strains were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Protein spots remarkly increased in different clinical drug resistant Mtb strains were digested in gel by enzyme and the mass of generated peptides were measured by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry（MALdI-TOF-MS）. The date obtained from peptide mass fingerprinting were used in protein database search. These genes of all strains were sequenced. Results The total resistance rate was 18.50%（138/746）， multi-drug-resistant rate was 4.42%（33/746）， mono-drug-resistant rate was 9.92%（74/746）， poly-drug-resistant rate was 4.16%（31/746）. Drug resistance rates ranked from high to low as isoniazid（INH， 11.53%，86/746）， streptomycin（Sm， 10.86%，81/746）， rifampicin（RFP， 5.36%，40/746）， ethambutol（EMB， 4.29%， 32/746）. nitial drug resistance rate and acquired drug resistance rate was 17.22%（115/668） and 29.49%（23/78） respectively， and acquired drug resistance rate was higher than the initial drug resistance rate，there was a statistically significant difference（χ2=6.976，P<0.01）. In all protein spot differences， 5 protein spots were upregulated inisoniazid-resistant strains and identified as Rv0444c， Rv1446c， Rv3146， Rv3002c and Rv2159c by （MALdI-TOF-MS）. Conclusion Mycobacterium tuberculosis resistant rate remains at low levels in the First Hospital of Jiaxing nearly two years.5 protein spots（Rv0444c， Rv1446c， Rv3146， Rv3002c and Rv2159c） might be associated with drug resistance mechanism.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Drug-resistant spectrum； Comparative proteomics； Drug resistance mechanism

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的一种慢性传染病。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，耐药结核病的传播流行是目前我国结核病疫情居高不下的重要原因，其出现和蔓延，严重阻碍了我国结核病防治工作的进程，已成为严重的公共卫生和社会问题。

现有的结核诊疗技术已经无法应对国内外日益严峻的结核病疫情，围绕这一疾病的预防、早期诊断和治疗等全面开展研究，据此推动结核分枝杆菌免疫、致病、耐药机制等基础研究的前进步伐，不仅是结防工作者的共识，也是中国作为世界耐药结核“特别引起警示的国家和地区”的现实需求，在这种情况下，分析本院2016～2017年结核分枝杆菌的耐药情况，应用比较蛋白质组学技术了解结核分枝杆菌蛋白质结构及空间差异、相互作用与联系，进一步阐述耐药分子机制显得尤为必要。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 调查对象 选择2016年1月～2017年6月嘉兴市第一医院痰结核分枝杆菌培养阳性的结核病患者746例。患者基本情况见表1。

1.1.2 菌株来源 培养阳性的菌株均在嘉兴市第一医院结核病实验室统一做药敏试验，选择其中经药敏试验鉴定的单耐异烟肼菌株（3株）、单耐利福平菌株（3株）和耐多药菌株（4株）（其中包括异烟肼+利福平、异烟肼+利福平+乙胺丁醇、异烟肼+利福平+链霉素、异烟肼+利福平+链霉素+乙胺丁醇）；结核分枝杆菌标准菌株H37Rv（由国家参比实验室提供）。

1.1.3 主要仪器 PowerPac 3000电泳仪，PROTEAN IEF Cell等电聚焦电泳仪，PROTEAN Ⅱ Xi Cell垂直板电泳仪，Molecular Image Fx凝胶图像扫描仪，PDQuest6.0图像分析软件，均为美国Bio-Rad公司产品。U-3000分光光度计为HITACHI公司产品，质谱分析系统为美国Applied Biosystems公司的Voyager System 6192基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。

1.2 方法

1.2.1 临床耐药结核分枝杆菌药敏试验 （1）746株痰培养阳性的结核分枝杆菌均选择异烟肼（0.l mg/L）、利福平（1.0 mg/L）、链霉素（1.0 mg/L）和乙胺丁醇（5.0 mg/L）4种常用抗结核药物进行体外药物敏感试验，采用《耐药检测指南》推荐的比例法，计算耐药百分比。（2）耐药分类：单耐药：结核分枝杆菌对一种抗结核药物耐药。多耐药：结核分枝杆菌对一种以上的抗结核药物耐药，但不同时包括异烟肼、利福平。耐多药：结核分枝杆菌对一种以上的抗结核药物至少同时包括异烟肼、利福平耐药。（3）药敏试验均采用已知参考标准的结核敏感株（H37Rv）作为质量控制对照。

1.2.2 临床耐药结核分枝杆菌的细菌学实验 利用扫描电镜、透射电镜分析泛耐药菌株细胞形态、细胞壁形态变化

1.2.3 结核分枝杆菌培养及蛋白质组分分离 将菌株接种到添加了10%ADC（0.5%牛血清白蛋白，0.2%葡萄糖，140 mmol/L NaCl）和0.5%甘油的Middlebrook 7H9中，37℃恒温培养箱中静置培养15～20 d，菌体浓度为1×108～2×108或光密度（OD600）为0.8～1.0收取菌体。80℃水浴加热0.5 h以杀死细菌。超声破壁，获得细胞组份蛋白。

1.2.4 利用比较蛋白质组学方法分析耐药结核分枝杆菌的差异表达蛋白 应用生物信息学理论和技术，综合分析获得的若干耐药结核杆菌和药物敏感菌株之间的差异蛋白。蛋白质组学方法—双向电泳技术（2D-Electrophoresis）：第一向：固相pH梯度等电聚焦凝胶电泳（用自制的电泳上样缓冲液，17 cm的胶条，pH 4～7、3～10）。采用被动水化，低电压胶内泡胀法。聚焦结束后，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。第二向：聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。配制12%的聚丙烯酰胺凝胶，将IPG胶条面朝上放在凝胶的长玻璃板上。起始时用低电流（5 mA/gel/17 cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20～30 mA/gel/17 cm），溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。取出凝胶，并切角以作记号。

1.2.5 肽指纹图谱鉴定与分析 蛋白凝胶银染后，凝胶用Molecular Image Fx激光图像扫描仪扫描，配比分析采用PDQuest 6.0软件完成。

筛选差异蛋白质斑点，加适量消化液（50 mmol/L NH4HCO3，5 mmol/L CaCl2，12.5 ng/μL Trypsin）消化，抽干，加0.5%TFA溶解。MALDI-TOF-MS肽指纹图谱分析并鉴定PepIdent（www.expasy.org/tools/peptident.pl）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件统计分析数据。计量资料用（x±s）表示，计数资料以描述性统计分析，对耐药率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药基本情况

746株結核分枝杆菌中，608例对4种抗结核药物全部敏感，占81.50%，138例患者耐药，总体耐药率为18.50%；其中单耐药74例，单耐药率为9.92%；耐多药33例，耐多药率为4.42%；多耐药31例，多耐药率为4.16%。4种药物的耐药率由高到底依次为H 11.53%（86/746）、S 10.86%（81/746）、R 5.36%（40/746）、E 4.29%（32/746）。见表2。

2.2 耐药谱分析

四种药物均有单耐药情况发生；耐多药有四种组合：HR、HRS、HRE、HRSE；多耐药有五种组合：HS、HE、RS、SE、HSE。单耐药以耐S最多，耐多药以耐HRSE最多，其次是HR，多耐药以耐HS最多。初治患者耐药顺位为S（10.78%，72/668）、H（10.03%，67/668）、R（14.07%，27/668）、E（3.89%，26/668），复治患者耐药顺位为H（24.36%，19/78）、R（16.67%，13/78）、S（11.54%，9/78）、E（7.69%，7/78）。见表3。

2.3 初复治患者耐药情况分析

初治患者668例中耐药115例，初治总耐药率为17.22%；耐多药21例，初治耐多药率为3.14%。复治患者78例中耐药23例，复治总耐药率为29.49%；耐多药12例，复治耐多药率为15.38%。复治总耐药率高于初治总耐药率（χ2=6.976，P<0.01），复治耐多药率高于初治耐多药率（χ2=24.753，P<0.01）。

2.4 耐药结核分枝杆菌的比较蛋白质组学研究结果

运用PDQuest6.0图像分析软件对临床不同耐药模式菌株、全敏菌株及H37Rv菌株进行分析，共发现21个差异表达蛋白点，经切割消化后，进行MALDI-TOF-MS检测，并根据试验方法中叙述的数据库搜索方法对这些差异点进行鉴定（表4）。其中5个蛋白的检出率在耐药菌株中相对较高、质谱分析获得明确的肽质量指纹图谱，分别为Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c（封三图2、图3，表5）。

3 讨论

本研究746株结核分枝杆菌中，总耐药率为18.50%（138/746），耐多药率为4.42%（33/746），其中初治耐药率和复治耐药率分别为17.22%（115/668）、29.49%（23/78），初治耐多藥率和复治耐多药率分别为3.14%（21/668）、15.38%（12/78），耐单药顺位从高到低依次为INH（11.53%）、Sm（10.86%）、RFP（5.36%）、EMB（4.29%），与2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果相比（总耐药率为36.8%，初治耐药率为36.9%，复治耐药率35.9%，总耐多药率6.8%，初治耐多药率为5.4%，复治耐多药率为15.4%，耐药顺位为INH 28.6%、Sm 19.6%、RFP 8.9%、EMB 6.8%），耐药率略低于全国流调水平[1]。单耐药率为9.92%（74/746），耐多药率为4.42%（33/746），低于潘稚芬等[2]报道的嘉兴一院2004～2010年耐药监测结果（单耐药率为17.28%，耐多药率为27.84%）。究其原因是由于嘉兴市第一医院自2013年以来开展了全球基金耐多药防控策略，其中包括所有涂阳肺结核患者早期结核分枝杆菌液体培养，GeneXpert、基因芯片等快速分子生物学检测技术的应用；确诊的耐药肺结核患者均给予免费治疗，每一例患者治疗方案均由市级专家组讨论决定，根据患者实际病情，使用标准及个体化相结合的耐药结核治疗方案，剂量根据药代动力学特征计算，严格执行2个月住院治疗（静脉用药），6个月强化期（注射）治疗，18个月巩固期治疗；辅以医务人员全程督导，并适当给予患者营养及交通补助，提高服药的依从性，以上措施使肺结核的治愈率达到85%以上，耐多药肺结核的治愈率也达到70%以上，本研究结果说明近四年嘉兴一院耐多药肺结核病防控策略取得了一定的成效。

利用比较蛋白质组学方法分析耐药结核分枝杆菌的差异表达蛋白，发现差异表达的21个蛋白质点中，新增2个、缺失6个、8个上调表达、2个下调表达、3个异常表达。这些差异蛋白主要为中间代谢/呼吸作用蛋白、调节蛋白、细胞壁和细胞外排系统和PE/PPE成员相关蛋白及保守假定蛋白。质谱分析后获得5个明确的肽质量指纹图谱，分别为Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c。

Rv2629c编码的是一种保守假定蛋白，研究发现，这种蛋白是结核分枝杆菌进入潜伏生长状态高表达标志蛋白，存在于细胞膜和细胞壁，与利福平耐药机制密切相关。耐药菌可以通过降低生活能力，进入潜伏状态来抵抗外界的不良环境，或以这种进入潜伏状态的方式降低与药物的作用效率，从而降低或抵抗抗生素对其的杀灭作用[3]。研究发现结核分枝杆菌胞内生长72 h后，耐药株中Rv2629基因上调明显。另有动物实验发现[4]过表达Rv2629的细菌感染小鼠20 d后，其脏器存活数多于对照组。而小鼠肺泡结构被炎性浸出物渗透和炎性细胞浸润，肺泡壁充血增厚，有明显的肉芽肿形成。以上结果均说明耐药菌株中过表达的Rv2629可能提高其存活率和致病性，与其耐药机制密切相关。进一步研究[5]发现Rv2629蛋白可能属于药泵体系，该体系最常见的主要是易化超家族（major facilitator superfamily，MFS）和ATP结合盒家族（ATP-binding cassette，ABC），但具体属于哪一种类型及其所发挥的具体机制都需要进一步证据加以证实。

RshA是由Rv0444c表达的一种SigK操纵子抑制蛋白，该蛋白在临床耐多药菌株中表达下调，说明Rv0444c可能是与耐药相关的基因。耐药结核杆菌通过RskA的下调表达，弱化了对SigK的负调控，导致MPT83抗原蛋白的上调表达，并通过光镜发现Rv0444c的过表达可导致菌落边缘整齐，折光性增强，细胞壁有增厚趋势，由此可推测增厚的胞壁减低了抗结核药物穿胞杀菌作用[6]，然而实验发现MPT83抗原蛋白的上调表达却不影响耐药菌生长。另有研究[7]称该蛋白还能够介导细菌对阿米卡星、卷曲霉素耐药。

Rv1446c编码的opcA蛋白是一种膜蛋白，其功能可能是磷酸戊糖途径中辅助葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的一种蛋白质。研究发现Rv1446c参与耐异烟肼结核分枝杆菌耐药机制形成[8-10]。目前对该蛋白质的深入研究少有报道。Rv2159c编码的是一种保守假定蛋白，亦属于结核分枝杆菌膜蛋白，该蛋白在耐多药菌株和单耐异烟肼菌株中都呈下降趋势，可能会导致结核分枝杆菌对宿主的侵袭能力下降[11]。Rv3002c编码的是乙酰羟酸合成酶小亚基（ilvN），该蛋白存在于支链氨基酸代谢途径，ilvN仅在临床耐多药株中新增表达，为耐多药发生机制提供线索，并可能成为抗耐多药结核的药物设计靶标和可能的耐药检测标准[12-13]。Rv3146又叫做NADH-CoQ氧化还原酶B链（nuoB），其在双耐药菌株的菌体蛋白中表达异常，属于中间代谢和呼吸作用相关蛋白[14]。对nuoB蛋白的抗原表位分析发现，其可在耐多药结核患者中激起较高水平的体液免疫反应，具有耐药结核血清学鉴别诊断的能力[15]。

综上所述，嘉兴一院结核病患者总体耐药率略低于2010年全国流调水平，这得益于本地区有效的防控措施，但复治患者耐药率、耐多药率高于初治患者，且初复治耐药顺位不同，因此，在治疗时应根据患者不同类型、药敏试验及本地区结核分枝杆菌耐药特点，制定个体化的化疗方案[16-17]。另外，应用比较蛋白质组学的方法，找到了临床不同耐药菌株和敏感株之间差异表达蛋白，但这些蛋白耐药机制仍需进一步的实验证实。上述蛋白是筛选新型药物和诊断抗原的焦点，本研究为寻找新的药物靶标以及筛选不同临床耐药模式菌株诊断抗原提供方向，并为今后本地区耐药结核科学防控策略提供科学依据。

[参考文献]

[1] 王黎霞，成诗明，陈明亭.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508.

[2] 潘稚芬，高跃中，刘加良，等.嘉兴市全球基金耐多药肺结核防治策略分析[J].中国现代医生，2016，54（7）：131-135.

[3] Zhang L，Xu W，Cui Z，et al.A novel method of identifying Mycobacterium tuberculosis Beijing Strains by Detecting SNPs in Rv0444c and Rv2629[J]. Curr Microbiol，2014，68（3）：381-386.

[4] Feuerriegel S，K？觟ser CU，Niemann S. Phylogenetic polymorphisms in antibiotic resistance genes of the Mycobacterium tuberculosis complex[J].J Antimicrob Chemother，2014，69（5）：1205-1210.

[5] Velayati A A，Abeel T，Shea T，et al.Populations of latent Mycobacterium tuberculosis lack a cell wall：Isolation，visualization，and whole-genome characterization[J].Int J Mycobacteriol， 2016，5（1）：66-73.

[6] Zhang L，Xu W，Cui Z，et al. A novel method of identifying Mycobacterium tuberculosis Beijing Strains by Detecting SNPs in Rv0444c and Rv2629[J]. Curr Microbiol，2014，68（3）：381-386.

[7] Jhingan GD，Kumari S，Jamwal SV，et al.Comparative proteomic analyses of avirulent， virulent，and clinical strains of Mycobacterium tuberculosis identify strain-specific patterns[J]. J Biol Chem，2016，291（27）：14257-14273.

[8] Schubert OT，Ludwig C，Kogadeeva M，et al.Absolute proteome composition and dynamics during dormancy and resuscitation of Mycobacterium tuberculosis[J].Cell host & microbe，2015，18（1）：96-108.

[9] Holyoake LV，Hunt S，Sanguinetti G，et al.CydDC-mediated reductant export in Escherichia coli controls the transcriptional wiring of energy metabolism and combats nitrosative stress[J]. Biochem J，2016，473（6）：693-701.

[10] Sharma D，Bisht D. An efficient and rapid method for enrichment of lipophilic proteins from Mycobacterium tuberculosis H37Rv for two-dimensional gel electrophoresis[J].Electrophoresis，2016，37（9）：1187-1190.

[11] Balhana RJC，Singla A，Sikder MH，et al.Global analyses of TetR family transcriptional regulators in mycobacteria indicates conservation across species and diversity in regulated functions[J].BMC Genomics，2015，16（1）：479.

[12] Xu G，Ni Z，Shi Y，et al.Screening essential genes of Mycobacterium tuberculosis with the pathway enrichment method[J]. Mol Biol Rep，2014，41（11）：7639-7644.

[13] Amorim Franco TM，Blanchard JS.Bacterial Branched-Chain Amino Acid Biosynthesis：Structures，Mechanisms， and Drugability[J]. Biochemistry，2017，56（44）：5849-5865.

[14] Williams KJ，Jenkins VA，Barton GR，et al.Deciphering the metabolic response of Mycobacterium tuberculosis to nitrogen stress[J]. Mol Microbiol，2015，97（6）：1142-1157.

[15] Kapoor N，Pawar S，Sirakova TD，et al. Human granuloma in vitro model，for TB dormancy and resuscitation[J]. PLoS One，2013，8（1）：e53657.

[16] 黃静静，熊昌富，王春雷，等.2013-2014年海南省初复治涂阳肺结核患者耐药监测结果分析[J]. 中国防痨杂志，2017，39（1）：95-99.

[17] 李妍，王西娣，陈美玲，等.陕西地区6年间结核分枝杆菌耐药情况分析[J].临床肺科杂志，2017，22（8）：1489-1492.

（收稿日期：2018-01-04）