呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21检测对孤立性肺结节早期肺癌的诊断价值及临床相关性研究

罗家友 周凌燕 张丽娟 华锋 马志红 沈绮斌 王斌 崔恩海

[摘要] 目的 探討呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、P53蛋白、miRNA21在肺癌组患者中的诊断价值及临床相关性。 方法 随机选择2014年12月～2017年6月入住我院呼吸科的胸外科孤立性肺结节需手术切除患者51例，根据术后病理将孤立性肺结节患者分为肺癌组35例、非肺癌组16例，同期体检者12例为对照组。所有患者均采集呼出气冷凝液、空腹静脉血。采用全自动化学发光免疫分析仪测定CEA水平、酶联免疫吸附试验测定P53蛋白水平、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR法）测定miRNA21水平，分析呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21对孤立性肺结节早期肺癌的诊断价值。 结果 肺癌组EBC的CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平均高于非肺癌组与对照组（P<0.05）；肺癌组患者EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平与性别、年龄、TNM、病理类型差异均无统计学意义（P>0.05）；联合检测EBC的CEA、P53蛋白、miRNA21对孤立性肺结节早期肺癌的诊断敏感性、特异性均优于单项检测（AUC 0，931 P<0.05）。 结论 联合检测呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21有助于孤立性肺结节早期肺癌的筛查，提高诊断的敏感性和特异性。

[关键词] 呼出气冷凝液；癌胚抗原；P53蛋白；miRNA21；孤立性肺结节；早期肺癌、诊断价值；相关性

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）07-0005-04

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value and clinical correlation of exhaled breath condensate（EBC） carcinoembryonic antigen（CEA）， P53 protein and miRNA21 in lung cancer patients. Methods 51 patients with solitary pulmonary nodules in need of surgical incision who were admitted to the department of respiratory medicine and the department of thoracic surgery in our hospital from December 2014 to June 2017 were randomly selected. According to the postoperative pathology， the patients with solitary pulmonary nodules were divided into lung cancer group（n=35）， non-lung cancer group（n=16）. In the same period， 12 cases receiving physical examination were selected as the control group. Exhaled breath condensate and fasting venous blood were collected in all patients. The CEA level was measured by using the automatic chemiluminescence immunoassay analyzer. The level of P53 protein was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and the level of miRNA21 was tested by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-PCR）. The diagnostic value of exhaled breath condensate CEA， P53 protein and miRNA21 in solitary pulmonary nodules in early stage of lung cancer was analyzed. Results The levels of CEA， P53 protein and miRNA21 expression of EBC in lung cancer group were significantly higher than those in non-lung cancer group and control group（P<0.05）； the levels of CEA， P53 protein and miRNA21 expression of EBC in lung cancer group were not statistically significantly different from those in gender， age， TNM and pathological types（P>0.05）； the diagnostic sensitivity and specificity of combined detection of CEA， P53 protein and miRNA21 of EBC in solitary pulmonary nodules in the early stage of lung cancer were better than single detection（AUC 0.931， P<0.05）. Conclusion Combined detection of CEA， P53 protein and miRNA21 of EBC is helpful for the screening of solitary pulmonary nodules in the early stage of lung cancer and improve the sensitivity and specificity of diagnosis.

[Key words] Exhaled breath condensate； Carcinoembryonic antigen（CEA）； P53 protein； miRNA21； Solitary pulmonary nodules； Early lung cancer； Diagnostic value； Correlation

肺癌是最常见的恶性肿瘤，是发病率第一、最致命的恶性肿瘤之一，中国的肺癌占全球1/3以上[1，2]，由于起病隐匿，早期缺乏典型临床症状，70.0%以上患者确诊时已经是中、晚期，丧失手术根除机会，严重影响人民健康[3]，因此对早期肺癌的筛查成为呼吸科研究的热点。本课题随机选择2014年12月～2017年6月入住我院呼吸科、胸外科的需手术切除的孤立性肺结节肺癌患者51例作为研究对象，探讨呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21对早期肺癌的筛查价值及临床相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择2014年12月～2017年6月入住我院呼吸科、胸外科的孤立性肺结节需手术切除患者51例，根据术后病理分为肺癌组和非肺癌组。肺癌组男23例，女12例，年龄42～75岁，平均（63.27±7.92）岁，病灶直径0.8～3.0 cm；病理类型：鳞癌5例，腺癌30例；TNM分期：Ⅰa期18例、Ⅰb期11例、Ⅰc期6例。非肺癌组16例，男10例，女6例，年龄40～76岁，平均（64.09±7.97）岁，病灶直径0.9～2.9 cm。选择同期健康体检者12例作为对照组，男7例，女5例，年龄50～57岁，平均（53.50±4.31）岁。本课题得到医院伦理委员会同意，患者及家属对治疗方案具备知情权。三组的性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：（1）符合孤立性肺结节肺癌、孤立性肺结节非肺癌临床诊断标准者[7]；（2）最终均经过影像学检查、手术病理或组织学检查得到确诊；（3）能遵循医嘱完成相关检查及诊断者。排除标准：（1）肺内多发结节或最大直径大于3.0 cm肿块；（2）合并其他恶性肿瘤及全身免疫性疾病者；（3）严重心肺疾病不能耐受呼出气冷凝液检查。

1.3 方法

13.1 EBC采集 EBC收集采用EricJaeger Company生产的EcoScreen冷凝器采集，所有研究对象要求禁食禁烟12 h，于晨起空腹时进行EBC采集，在EBC收集之前半小时，不做用力肺活量、时间肺活量、最大通气量检查。受试者漱口清洁口腔，在25℃的室温环境下进行平静呼吸，戴鼻夹通过单向活瓣平静呼吸，呼出气在收集器-5℃低温收集管中可冷凝变为液状物，取出收集管，将收集到3～4 mL的EBC装入无菌标本管内，然后立即置于-70℃低温冰箱内保存。收集过程中若有唾液或痰液随时将其吐出，以避免影响检测结果。对所有收集的EBC检测唾液淀粉酶排除唾液的污染，若唾液淀粉酶检测阳性需次日重新采集并达到要求。

1.3.2 血清采集 采集51例孤立性肺结节患者、12例健康体检者的外周静脉血5 mL，10 min离心，速度为5000 rpm，仔细抽取上层血清，将其放置在-70℃冰箱中保存。

1.3.3 檢测方法 采用全自动化学发光免疫分析仪测定CEA水平；采用酶联免疫吸附试验测定三组P53蛋白水平，有关操作严格遵循试剂盒、仪器说明书完成；采用实时荧光定量PCR（RT-PCR法）测定三组miRNA21水平。采用反转录试剂盒（ABI公司生产提供）完成miRNA的反转录，保证反转录整个体系为15 μL，通过查阅Sanger micro-RNA序列获得miRNA21相应的序列引物，根据每一位标本情况设置反转录条件：16℃下30 min，42℃下30 min，85℃下5 min，最后在4℃下保持恒温，将获得的反转录产物采用RT-PCR系统完成定量检测，保证整个反应体系为20 μL，设置PCR检测反应条件：95℃下10 min，95℃下15 s，60℃下1 min，连续进行40个循环。最后通过PCR自带软件获得基线与阈值后，将miR16作为内参，读取相应miR16、miR21循环阈值，计算两种循环阈值，采用两种循环阈值表示miRNA21表达水平[8，9]。

1.4 观察指标

（1）观察肺癌组与非肺癌组及对照组呼出气冷凝液、空腹静脉血中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平情况。（2）观察肺癌组各亚组EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平差异性；（3）评估联合与单一检测EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21在早期肺癌的诊断敏感性、特异性。

1.5统计学方法

采用SPSS18.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用[n（%）]表示，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，对EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21诊断效能绘制ROC曲线，与标准曲线进行比较获得敏感性、特异性参数，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平比较

肺癌组EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平均高于非肺癌组与对照组（P<0.05），但血清检测结果与非肺癌组和对照组无统计学差异（P>0.05）；非肺癌组与对照组EBC及血清中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 肺癌组临床特征与EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21相关性

肺癌组患者EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平与性别、年龄、TNM分期、病理类型无统计学差异（P>0.05）。见表2。

2.3 肺癌组EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21诊断效能

单项检测CEA、miRNA21对早期肺癌诊断敏感性和特异性较P53蛋白高（P>0.05）；联合检测CEA、P53蛋白、miRNA21诊断肺癌的敏感性、特异性高于单一检测（AUC 0.931，P<0.05）。见表4、封三图1。

3 讨论

肺癌是临床上常见的疾病，具有发病率高、死亡率高、治愈率低等特点，随着我国工业化程度的进程、空气雾霾的加剧，肺癌发病率呈明显上升趋势，严重影响我国居民健康[4]。孤立性肺结节（pulmonary nodule）是指边界清楚、影像学不透明并且直径≤3 cm，周围完全被含气肺组织包绕的肺部结节[5-6]。多数肺癌患者[7-8]发病早期以孤立性结节为主要表现，肺癌、淋巴瘤、肺转移性肿瘤、肉芽肿、特异性肉芽肿感染均可表现为肺结节，尽管高分辨CT能为我们提供较多的影像学信息，但仍有较高的误诊率[9-10]。呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）检测方法是一种新的无创收集下呼吸道挥发性及非挥发性物质的方法，具有无创伤、收集简单、患者易接受、可反复进行等优点。大量研究表明，在确诊非小细胞肺癌（NSCLC）患者的EBC中能检查多种肿瘤指标，且具有较高的敏感性、特异性，可能成为肺癌早期诊断、筛查肿瘤高危人群的一种新途径[11-12]。

CEA是一种富含多糖的蛋白复合物。对肿瘤的诊断、预后、复发判断有意义，是检测肿瘤的首选标志物之一。miRNA与肿瘤密切相关，在人类基因组中已鉴定的1000多个miRNA中，2002年Calin GA等[6]首次揭示了miRNA的异常调控与肿瘤的相关性。由于miRNA与众多肿瘤相关，故外周血检测结果很难确定与肺癌相关性，EBC来自于肺部，其中所含的微量miRNA主要来自于肺部，故对EBC中miRNA的检测有助于肺癌的诊断，有研究显示[13-15]，miRNA21在NSCLC的血和EBC中高表达。本研究显示，孤立性肺结节肺癌组EBC中CEA浓度、miRNA21与非肺癌组及对照组有统计差异，与肺癌的分期及病理类型无相关性，对肺癌诊断的敏感性及特异性均较高（AUC：0.875、0.892，P<0.05），是筛查早期肺癌的较为敏感指标[16-17]。P53蛋白是一种由-53抑癌基因编码的蛋白，能直接参与機体细胞周期的调控、DNA的修复与合成。P53基因发生突变后将会造成癌变、突变型P53蛋白呈高表达[18]。本研究结果显示，非小细胞肺癌患者EBC中p53蛋白的浓度明显高于非肺癌组及对照组，与肺癌的分期、病理类型及分化程度无差异，与有些文献[19-20]报道相符，但EBC中P53蛋白对孤立性肺结节早期肺癌筛查的敏感性和特异性较CEA和miRNA21低（AUC 0.706，P>0.05），可能与EBC中P53蛋白来自于除肺以外的多个部位如咽部、口腔等有关。本研究显示，孤立性肺结节肺癌组EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平，均高于非肺癌组与对照组（P<0.05），与性别、年龄、TNM、病理类型无统计学意义（P>0.05），三项指标对早期肺癌诊断敏感性及特异性比较发现，CEA、miRNA21相比P53蛋白好，三项联合检测敏感性及特异性更高（AUC 0.931，P<0.05），能发挥不同检测指标优势，达到优势互补，提高孤立性肺结节早期肺癌的筛查准确率，改善患者预后，值得临床试验性应用并进一步验证。

综上所述，联合检测呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21有助于孤立性肺结节早期肺癌的筛查，提高诊断的敏感性和特异性。

[参考文献]

[1] Ferlay J，Soerjomataram I，DikshitR，et al.Cancer incidence and mortality worldwide：Sources，methods and major patterns in globocan 2012[J].International J Cancer，2015，136（5）：E359-E386.

[2] Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].Cancer Journal for Clinicians，2016，66（2）：115-132.

[3] Carrizosa DR，Gold KA.New strategies in immunotherapy for non-small cell lung cancer[J].Translational Lung Cancer Research，2015，4（5）：553-559.

[4] Ost D，Fein AM，Feinsilver SH.Clinical practice.The solitary pulmonary nodule[J].N Engl J Med，2003，348（25）：2535-2542.

[5] Chan HP，Lewis C，Thomas PS.Exhaled breath analysis：Novel approach for early detection of lung cancer[J]. Lung Cancer，2009，63：164-168.

[6] Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletion saild down-rcgLllation of micoRNA genes miRl5 and miRl6 at13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J].Pmc Natl，2002，99（20）：524-529.

[7] Landi MT，Zhao Y，Rotunno M，et al.MicoRNA elpression differentiates histology and predicts survival of lung cancer[J].Clin Cancer Res，2010，16（14）：430-441.

[8] Wei J，Gao W，Zhu CJ ，et al.Identification of plasma microRNA-21 as a biomarker for ealy detection and chemosensitivity of nonsmall cell lung cancer[J].Chin J Cancer，2011，30（6）：407.

[9] Ying CZ，Lin W，Cong Z，et，al，CEA，SCC and NSE levels in exhaled breath condensate possible markers for early detection of lung cancer[J]. J Breath Res，2013，7：047101-047111.

[10] Paola M，Iris B，Matteo G，et al. Plasma and EBC microRNAs as early biomarkers of non-small-cell lung cancer[J].Biomarkers，2013，18（8）：679-686.

[11] 肖平，陈建荣，蔡映云，等.非小细胞肺癌患者呼出气冷凝液中p5 3蛋白检测的临床意义[J].国际呼吸杂志，2011，31（10）：731-735.

[12] 冯哲敏 陈建荣.非小细胞肺癌患者呼出气冷凝液及肿瘤组织中P53蛋白的检测[J].国际呼吸杂志，2012，32（17）：1310-1313.

[13] 季禹乔，孙明忠，朱晖，等. 血清miRNA-21与肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、NSE对早期非小细胞肺癌的诊断价值[J]. 中国实验诊断学，2017，21（4）：576-581.

[14] 陈君峰，陈立军，李相国，等. 联合检测胸水VEGF p53蛋白 CEA水平对恶性胸腔积液的诊断价值[J]. 浙江临床医学，2016，18（11）：2044-2045.

[15] 奚小祥，吕必宏，叶婷，等. NSE、Cyfra21-1、CEA及CA125在孤立性肺结节诊断中的价值[J]. 实用临床医药杂志，2015，19（21）：41-43.

[16] 张亚娟，张健鹏，常德，等. CEA、纤维蛋白原对孤立性肺结节良恶性诊断价值[J]. 中华灾害救援医学，2017， 5（3）：138-142.

[17] 劉颖，李华强，罗治海，等. CEA、NSE、CYFRA21-1联合检测对肺癌的早期诊断价值[J]. 医学综述，2016，22（9）：1774-1776.

[18] 赵运旺. 肿瘤标志物癌胚抗原及细胞角蛋白19片段对早期肺癌的诊断价值[J]. 甘肃科技，2017，33（1）：88-92.

[19] 吴振永. 微小核糖核酸（miRNA）联合C反应蛋白检测对肺癌早期的诊断价值[J]. 实用癌症杂志，2017，32（7）：1062-1064.

[20] 周竞奇. NSE、CEA、CYFRA21-1与 GP73对肺癌的诊断价值[J]. 中国实用医刊，2017，44（1）：70-73.

（收稿日期：2017-09-28）