海岛棉GbTCP14基因的克隆与表达分析

蔡永生，郑 凯，王 怡，贺宏伟，曲延英，倪志勇，陈全家

(新疆农业大学 农学院，农业生物技术重点实验室，乌鲁木齐 830052)

棉花提供了世界上绝大部分的天然纤维，而且是一种重要的可再生资源[1]。中国是世界上棉花生产和消费大国，棉花在经济作物种植面积中占有举足轻重的地位，棉纤维提供纺织工业的原材料[2]。如今，随着植物发育生物学研究的迅猛发展，许多重要的发育机制在分子水平上得到阐明，但因为棉花是四倍体，基因组庞大、生长周期较长、遗传关系复杂等因素，所以棉花发育生物学研究进展较为缓慢。

植物转录因子通过调控下游基因的转录表达，不仅成为整个生命活动的重要控制者，而且作为功能基因组学的重要组成部分。转录因子又称反式作用因子，能够与真核基因启动子区域DNA序列特异结合的一类蛋白质分子，一般具有激活或抑制基因转录的功能，直接或间接参与代谢过程[3]。在1999年，最早发现的几个TCP家族成员分别为玉米teosintebranched1(TB1)、金鱼草cycloidea(CYC)和水稻PCF1、PCF2基因，TCP家族名称由这几个基因首字母所命名[4]。通过对这4个基因序列比较发现，序列中均含有一个保守区域，也就是TCP结构域(TCP domain)。TCP结构域是由59个氨基酸组成的高度保守的区域，可以形成一个非典型的碱性螺旋-环-螺旋结构(noncanonical basic-Helix-Loop-Helix(bHLH)structure)[5]。研究表明,bHLH中的碱性区提供与DNA相作用的表面，推测蛋白可能参与核定位信号、蛋白质的二聚化和与 DNA 结合的功能，在TCP结构域中包含与DNA识别区域，删除该区域则导致DNA结合活性丧失[6]。除了bHLH结构外，CYC和TB1还有一个保守的富含极性氨基酸的区域，大约有18个氨基酸组成，可以形成一个亲水α螺旋的R结构区[7]。根据TCP结构域序列的特点,TCP家族又被分成2个亚族ClassⅠ和ClassⅡ，主要差异在于NLS序列完整性差异和R结构区的存在与否。

在拟南芥中已基本确定具有24个TCP转录因子[8]。研究表明，拟南芥AtTCP1基因参与调控植物茎的生长[9]。拟南芥AtTCP11基因参与拟南芥维管束发育和木质部导管分子的分化和形成[10]。拟南芥AtTCP16基因对早期花粉的发育有重要作用[11]。拟南芥AtTCP20融合EAR抑制子的异位表达引起很特殊的表型，表明TCP家族基因在细胞分裂、伸长和分化调控中起到重要作用[12]。

TCP家族转录因子广泛参与不同植物的整个生长发育之中，目前，与棉花纤维发育相关的TCP转录因子研究处于兴起阶段。海岛棉纤维品质优良，具有优异的基因资源，已成为棉花品质改良、抗性遗传及杂种优势利用等研究重要的资源材料[13]。然而海岛棉优异纤维形成的分子机制尚未解析，使利用优异基因变得十分困难。新疆海岛棉育种历经多个阶段，现已育成37个海岛棉品种，‘新海21号’目前已成为南疆海岛棉主要栽培品种之一，具有结铃性强，丰产性好，适应性强，产量高而稳定等优点[14]。本研究将从海岛棉‘新海21号’棉纤维中克隆1个TCP转录因子，分析该基因的氨基酸序列和表达模式并进行转录激活验证，为后期研究提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试品种‘新海21号’种植于阿克苏地区农一师十六团新疆农业科学研究院试验基地。以开花当天记作0 DPA(开花后0 d)，依次摘取0 DPA的胚珠和5 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA、25 DPA、30 DPA、35 DPA的棉花纤维，以及0 DPA时期的花瓣、花萼和花托，置于液氮中速冻，保存于-80 ℃冰箱中备用。

于2016年10月20日收获田间种子，室内种植‘新海21号’种子摆放在纸床发芽盒中，28 ℃暗培养取下胚轴，部分移栽入土中继续生长，待第一片真叶展平时，取主根、须根、茎、叶，置于液氮中速冻，保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 方 法

1.2.1植物总RNA的提取和cDNA第一链的合成采用RNAprep Pur多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根试剂公司)，参照说明书，提取开花当天的胚珠、花瓣、花萼、花托及根、茎、叶、下胚轴的总RNA， 以及不同时期棉纤维等的总RNA。用RNase-Free DNasee 1(天根试剂公司)去除基因组DNA污染，用Thermo Scietific(NanoDrop 1000)分光光度计检测RNA质量浓度和质量，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。将RNA保存在-80 ℃冰箱中备用。

将不同时期棉纤维(0 DPA为胚珠)和不同组织的总RNA，使用First strand cDNA Synthesis试剂盒(Thermo试剂公司)反转录合成单链cDNA，反应体系参照说明书。反转录合成单链cDNA保存在-80 ℃冰箱备用。

1.2.2海岛棉GbTCP14基因的克隆以拟南芥AtTCP14基因(AT3G47620)的核苷酸序列作为参比序列，使用本地Blast在陆地棉基因组序列中进行比对，获得1条属于TCP家族基因的陆地棉全长cDNA序列。根据该序列最大开放阅读框(open reading frame)用Oligo7软件进行设计引物，获得GbTCP14-F和GbTCP14-R(表1)2条引物。

用引物GbTCP14-F和GbTCP14-R，以‘新海21号’5 DPA棉纤维合成的cDNA第一链作为模板，用高保真Taq聚合酶进行PCR扩增。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，使用紫外凝胶成像仪观察后切下目的片段。利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 (天根试剂公司)按说明书步骤，纯化回收PCR产物，连接至pMD19-T载体，转化入DH5α感受态细胞(全式金公司)。采用菌液PCR的方法鉴定出阳性克隆，送至深圳华大基因有限公司测序。

1.2.3生物信息学分析将测序结果采用GenBank和Blast的Blast程序进行同源性分析，采用NCBI的ORF程序在线(http://w ww.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找基因的开放阅读框并得到氨基酸序列。利用ProtParam(http://expas y.org/tools/protparam.html)在线计算氨基酸理化性质。利用PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)在线预测蛋白质的二级结构以及蛋白质的障碍和灵活性。利用DNAMA软件和SMARTBLAS(https://blast.Ncbi.nl m.ni h.gov/blast/smartblast/)在线进行氨基酸多重序列比对和一致性分析。利用ClustalX和MEGA6.0软件比对氨基酸序列构建系统发育树。

1.2.4GbTCP14基因酵母转化以克隆出的GbTCP14基因作为模板，使用Oligo 7软件设计1对包含酶切位点引物pGBKT7-GbTCP14-F和pGBKT7-GbTCP14-R(表1)。扩增GbTCP14完整的ORF编码区，纯化回收。采用推荐最佳反应体系用NcoⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶，双酶切PCR产物和空质粒pGBKT7(新疆农业大学生物技术重点研究室提供)。纯化回收目的片段，用T4DNA连接酶连接载体与目的片段，转化入DH5α感受态细胞，涂在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养12 h后挑取单克隆，提取质粒双酶切筛选阳性单克隆后送测序，验证载体构建的正确性。按照Frozen-EZ Yeast Transformation II 试剂盒(ZYMO RESEARCH)说明书操作步骤，将pGBKT7-GbTCP14和pGBKT7质粒转化酵母菌株AH109，将转化的感受态细胞接种色氨酸缺陷平板(SD/-Trp)，30 ℃培养3 d，将转化的阳性对照、pGBKT7-GbTCP14和pGBKT7质粒的菌液分别铺SD/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His培养基平板，30 ℃ 培养3～5 d后观察菌落的生长。

1.2.5GbTCP14基因实时荧光定量PCR根据已获得的目的基因序列，设计实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物GbTCP14-qF和GbTCP14-qR(表1)，以棉花的Ubiquitin7(UBQ7, GenBank 登录号为DQ116441)基因序列设计内参引物，引物序列为UBQ7-F和UBQ7-F(表1)。荧光定量PCR仪器为Applied Biosystems 7500实时定量PCR仪(美国应用生物系统公司)。将‘新海21号’不同时期的棉纤维和不同组织的cDNA用ddH2O稀释10倍后作为模板，检测GbTCP14基因在不同时期棉纤维和不同组织中的表达情况，用内参基因检测扩增效率一致性。RT-PCR扩增体系参照说明书。试验进行3次生物学重复，采用2-ΔCt法分析实验数据，数据分析采用Excel和DPS 10.0软件进行数据统计分析和作图。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 海岛棉GbTCP14基因的克隆与生物信息学分析

测序结果在NCBI上进行同源性分析表明，所得的片段(图1)为GbTCP14，该基因编码区序列长1 221 bp。利用Prot Param分析得出(图2)，表明该基因可编码一个由406个氨基酸组成的蛋白质，分子式C1892H2950N572O620S16，预测分子量为44.134 6 kD，等电点为6.88，脂肪系数55.49，总平均亲水性是-0.708，不稳定系数56.58。利用SMART软件预测蛋白质的保守功能域(http://smart.embl-heidelberg.de/)蛋白质结构域分析结果(图2)发现，GbTCP14蛋白序列不包含非常保守的R-domain，但位于第89位到261位氨基酸之间有一个TCP家族特有保守结构域，且结构域符合ClassⅠ型TCP家族基因所特有。推测该基因属于棉花TCP转录因子中ClassⅠ类转录因子，蛋白亲水性差，脂溶性强，为不稳定蛋白。

利用PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)在线预测蛋白质的二级结构见图3。图3的上方所表示为氨基酸序列，下方所表示为其所对应的二级结构，其中e代表延伸链(extended strand)，t代表β-转角(beta turn)，c代表无规则卷曲(random coil)，h代表α-螺旋(alpha helix)。分析结果为，GbTCP14蛋白由406个氨基酸组成，其中59个氨基酸可能成型α-螺旋，主要位于第139位至146位氨基酸、第215位至264位氨基酸以及第359位至364位氨基酸之间。33个氨基酸可能形成β-折叠和78个氨基酸可能形成延伸链，分别散布在整个蛋白质之中。236个氨基酸可能无规则卷曲，作为蛋白质的主要结构大量存在于蛋白质中。GbTCP14蛋白的α-螺旋主要是TCP保守结构域形成，无规则卷曲分散于整个蛋白中，共同形成一个非典型的碱性螺旋-环-螺旋结构，与bHLH转录因子结构相符合，推测可能是TCP的大量结构元件，以bHLH结构类似的方式与DNA结合参与植物的DNA转录过程。

M. Marker; 1. GbTCP14图1 棉花GbTCP14 基因PCR产物电泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR product of cotton GbTCP14 genes

A. GbTCP14蛋白的氨基酸序列；B. 蛋白结构示意图，方框部分代表TCP结构域图2 GbTCP14蛋白的氨基酸序列以及蛋白结构示意图A. Amino acid sequence of GbTCP14； B. Schematic diagram of GbTCP14, Box part represents TCP domain structureFig.2 GbTCP14 protein amino acid sequence and protein structure diagram

e.延伸链;c.无规则卷曲;t.β-转角; h.α-螺旋图3 GbTCP14蛋白二级结构预测e.Extended strand;c.Random coil;t.Beta turn;h.Alpha helixFig.3 Secondary structure prediction of GbTCP14 protein

GaTCP14.亚洲棉(XP_017636574.1)；GhTCP14.陆地棉(XP_016736368.1)；GrTCP14.雷蒙德氏棉(XP_012438750.1)；AtTCP14.拟南芥(NP_190346.2)；NtTCP14.烟草(XP_016472329.1)；OsTCP14.水稻(XP_015624016.1)；ZmTCP14.玉米(XP_008646257.1)；GmTCP14.大豆(XP_003549670.1)；TcTCP14.可可(XP_007037311.2)；CarTCP14.鹰嘴豆(XP_007037311.2)；GbTCP14.海岛棉图4 GbTCP14与其他TCP14氨基酸序列比对分析GaTCP14. Gossypium arboreum(XP_017636574.1)；GhTCP14. Gossypium hirsutum(XP_016736368.1)；GrTCP14. Gossypium raimondii(XP_012438750.1)；AtTCP14. Arabidopsis thaliana(NP_190346.2)；NtTCP14.Nicotiana tabacum(XP_016472329.1)；OsTCP14. Oryza sativa Japonica Group(XP_015624016.1)；ZmTCP14. Zea mays(XP_008646257.1)；GmTCP14. Glycine max(XP_003549670.1)；TcTCP14. Theobroma cacao(XP_007037311.2)；CarTCP14. Cicer arietinum(XP_007037311.2)；GbTCP14. Gossypium barbadenseFig.4 Comparison of GbTCP14 with other TCP14 amino acid sequences

借助DNAMAN软件将海岛棉GbTCP14与NCBI数据库中的木本棉(Gossypiumarboreum)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotianatabacum)、水稻(OryzasativaJaponica Group)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)、可可(Theobromacacao)、鹰嘴豆(Cicerarietinum) TCP14蛋白的氨基酸序列进行比较，结果(图4)表明，与海岛棉GbTCP14相似程度最高的是木本棉(98.28%)，其次为雷蒙德氏棉(95.32%)、陆地棉(95.57%)、可可(84.88%)、烟草(63.01%)、大豆(59.27%)、鹰嘴豆(60.09%)，较低的为拟南芥(38.65%)、玉米(42.19%)、水稻(40.97%)。表明这些TCP蛋白的氨基酸序列中都包含1个高度保守的TCP domain，其他区域的相似性较低。

2.2 海岛棉GbTCP14系统进化分析

利用MEGA 6.0软件对上述物种的TCP氨基酸进行同源性比较并构建系统发育树(图5)表明，GaTCP14和GhTCP14聚集在同一分支上，表明在生物进化过程中，GbTCP14基因与木本棉的同类基因亲缘关系较近。

2.3 GbTCP14转录激活活性分析

将pGBKT7-GbTCP14 和pGBKT7转化酵母菌株AH109后，涂布单缺SD/-Trp 营养型缺陷培养基，以pGBKT7-GbTCP5作为阳性对照，pGBKT7作为阴性对照，观察酵母菌落的生长情况。图6显示，转化pGBKT7-GbTCP5、GbTCP14-pGBKT7 和pGBKT7的酵母菌落都能正常生长，说明上述3个质粒均已转化到酵母中。而在含有X-gal的三缺SD/-Trp/-His/-Ade 营养型缺陷培养基上，转化GbTCP14-pGBKT7的酵母菌落和阴性对照pGBKT7的酵母菌落均不能正常生长，阳性对照酵母正常生长，菌落呈现蓝色。说明GbTCP14转录因子不具有转录激活活性，推测GbTCP14可能是一个转录抑制子。

2.4 GbTCP14表达模式分析

为了进一步分析GbTCP14基因在棉花不同纤维时期的表达模式，采用实时荧光定量PCR方法分析GbTCP14基因表达情况。由图7，A可知，GbTCP14基因在开花后棉纤维发育中均有表达。其中第15天时相对表达量达到最高，其次相对表达量由高到低分别为第10、5、20天以及开花当天，而在开花后第25天后相对表达量较低。图7，B显示，GbTCP14基因在棉花组织中均具有表达量，但不同棉花组织间相对表达量差异明显，在花瓣和花萼中相对表达量比其他组织高，其次相对表达量高低分别为茎、主根、须根、下胚轴、花托和叶。其中在花瓣中表达量最高，叶中表达量最低。一般认为棉花开花后大约第5～20天为棉纤维伸长分化的关键时期，在棉纤维代谢最旺盛时期GbTCP14基因较高表达，暗示该基因可能参与调控控制棉纤维生长发育的重要阶段。在棉花的花器官中高表达，可能参与花的生长分化过程。

图5 GbTCP14蛋白与其他植物相关蛋白序列的系统进化树Fig.5 Phylogenetic analysis of GbTCP14 protein with other related proteins in different plants

图6 GbTCP14转录因子的转录激活实验Fig.6 Transcriptional activation ability assay of the GbTCP14 transcription factor

3 讨 论

棉花纤维是棉花种子的种皮毛，是由胚珠外珠被上的表皮细胞发育而成的单细胞毛状体。生长发育和持续的时间受棉花的基因型和环境控制而呈现不一致。自1992年第一个纤维特异表达基因E6基因克隆以来，至今已经获得了大批棉花纤维发育相关的基因和表达序列标签[15]。然而这些基因在棉纤维中的功能还有待于进一步研究，绝大部分基因在纤维细胞中所起的功能尚不明确，至今纤维细胞的发育科学界仍然没有很好地揭示控制棉纤维细胞伸长的真正机制。

图7 GbTCP14基因在不同时期棉纤维和不同组织中的相对表达量Fig.7 The relative expression of GbTCP14 genes in different periods of cotton fiber and different tissues

棉花纤维细胞的分化与发育是一个复杂有序的过程,分化发育过程分为4个阶段，即纤维原细胞分化突起、纤维伸长、次生壁增厚和脱水成熟，各个时期具有不同特点但又相互重叠[16]。从转录水平分析，TCP家族转录因子在棉花中表达模式不同。葛宗鹤研究组从海岛棉纤维的cDNA文库中分离出编码344个氨基酸的I类TCP转录因子(指定为GbTCP)，GbTCP优势在开花后5～15 d在延长的棉纤维中表达[17]。海岛棉GbTCP15基因在棉花的茎部和第15天纤维中表达量较高[18]。GhTCP14主要在棉纤维细胞中表达，特别是在纤维细胞的起始和延长期[19]。GbTCP14基因在棉花发育过程中表达模式与现有研究比较具有异同点，在棉纤维发育中表达时间更长，组织中表达部位更多。棉纤维发育前三阶段作为生长分化的关键时期，发育的状况直接关系到棉纤维成熟后，棉纤维的产量与品质，暗示可能在棉纤维生长发育过程中起到一定的作用。TCP基因中CYC类主要控制花的对称性，与花青素的合成有关，属于TCP家族转录因子中ClassⅡ类。GbTCP14基因在棉花的花器官中具有显著的相对表达量。已有研究证明TCP基因之间具有相互催化或抑制的作用，在参与花的发育中，该基因是直接调控下游基因转录还是与其他蛋白互作间接参与代谢活动，有待于进一步研究蛋白的生物学性质，初步推测可能参与棉花花的分化与形成。

基因的转录调控是复杂的过程，转录因子作为植物中重要的调控因子，以不同方式参与调控植物表皮毛、根毛和生殖器官的发育以及光形态建成，调节次生代谢物等。本研究从‘新海21号’克隆出的TCP家族转录因子基因即GbTCP14，属于TCP转录因子家族的ClassⅠ类。一般认为该类具有促进植物的生长和分芽生殖。在最早发现的4个基因中，水稻PCF1和PCF2基因属于ClassⅠ类能够促进分生组织中PCNA基因的启动子组织特异性表达，主要使细胞核蛋白基因的启动子在G1期到S期被激活[20]。在拟南芥中，AtTCP14基因能促进细胞分裂素诱导的有丝分裂因子CyclinB1的转录活性，调节拟南芥花和叶对细胞分裂素的敏感程度[21]。在棉花中，夏桂先研究组从陆地棉中克隆了1个GhTCP14转录因子，在纤维早期发育阶段生长素上调GhTCP14的表达，在拟南芥中异源表达GhTCP14影响拟南芥生长素水平和分配，从而影响根和表皮的细胞的起始和伸长[19]。关于GbTCP14基因编码的蛋白生物学功能。酵母系统转录激活分析表明，该基因不具有自身转录激活活性，推测可能是一个转录抑制子或与其他蛋白互作时才具有转录激活活性。GbTCP14是否与同类家族基因具有类似或新功能还有待于进一步探究。

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