植物中lncRNAs的研究进展

王艳芳，苏婉玉，张 琳，曹绍玉，吕 霞，张应华，许俊强*

(1 云南农业大学 园林园艺学院，昆明 650201；2 云南农业大学 资源与环境学院，昆明 650201；3 云南农业大学 云南省滇台特色农业产业化工程研究中心，昆明 650201)

RNA是DNA经转录、翻译成蛋白质的纽带和桥梁，在生物体内扮演着十分重要的作用。根据是否具有编码蛋白质功能可分为两类：编码蛋白质的RNA(coding RNA)和不编码蛋白质的RNA(non-coding RNA，ncRNA)[1]。起初认为ncRNA是转录翻译过程中由RNA聚合酶Ⅱ产生的副产物，不具备任何生物学功能[2]。随着高通量测序的飞速发展和深入研究，对动物和人类全基因转录组分析，90%以上的转录区都转录为可能在生物体内承担着丰富功能的ncRNA[3-5]。根据ncRNA分子链长度，分为短链ncRNA(small non-coding RNA, sncRNA)和长链ncRNA(long non-coding RNA, lncRNA)[6-7]。近年来人们深入研究sncRNA，对其生物学特性、生物合成、作用机制以及转录水平上的调控功能等有了系统的认识[8-13]。

lncRNAs研究相对较晚，且仅在人类、动物中做了广泛的深入研究，表明它们在生物体转录水平都调节基因表达，参与生物体生长发育和细胞免疫的过程，与人类疾病、癌症的发生有密切关系[14-18]。而植物lncRNAs的研究才刚起步且相对较少，初步表明在生物体内具有重要功能，但其具体生物合成、作用机制、调节功能等仍不清楚。因此，本文就近几年国内外对植物lncRNAs的研究进行综述，期望对后续研究提供理论基础和参考。

1 lncRNAs的简述

1.1 lncRNAs的命名与来源

lncRNAs是真核生物中主要由RNA聚合酶Ⅱ转录产生的一类长度大于200个核苷酸且不具备编码蛋白功能的RNA分子[19-21]。lncRNA主要存在于动物[22-23]、植物[24]、酵母[25]和病毒[26]。在各细胞的细胞质、细胞器和细胞核中均有分布，但主要集中于细胞核[1]。

lncRNAs的生物来源较广泛，初步将其分为5大类[27]：①染色体重组过程中，由多个未转录基因与另一些独立基因并列重组产生的转录产物；②在逆转录复制过程中，由非编码RNA产生；③基因组中，由一段串联重复序列转录产生；④由蛋白质编码基因密码子错位而导致结构框架断裂产生；⑤转座效应，即在基因中直接插入1个转座子产生。

1.2 lncRNAs的分类

为了深入研究lncRNAs，依据不同因素对其进行了分类[26-31](表1)。目前lncRNAs仍没有统一的分类标准，但多以与编码蛋白质基因的相对位置的分类标准为研究对象[30]。

1.3 lncRNAs的结构与特征

lncRNAs的初级结构就是核苷酸的排列序列[32]。目前高级结构研究不深入，仅有少量报道涉及高级结构，其三级结构尚未确定，由于lncRNAs分子与RNA分子在多方面的相似性，通常以RNA为参考对象，预测lncRNAs的三级结构[33]。

lncRNAs基本特征是长度大于200 bp、无蛋白质编码能力[1-34]。lncRNAs有较少的外显子、内含子、无ORF(Open Reading Frame)及起始密码子和终止密码子、表达水平也较低、但组织特异性远高于编码RNA；大部分lncRNAs均由RNA转录酶Ⅱ转录而来、具有5′帽子和3′-polyA尾巴结构、选择性剪切模式及序列间保守性低；GC含量低导致细胞内的表达丰度低[19-20,27,35-38]。上述这些特点可能是造成lncRNAs不能编码蛋白质的原因[27,39-40]。

2 lncRNAs在植物中的研究

随着高通量测序技术的发展，在多种植物中陆续发现了大量lncRNAs，不仅局限于模式植物，它们也存在于小麦、玉米、棉花、番茄、黄瓜、大白菜等植物中。

表1 lncRNAs的分类

2.1 模式植物中lncRNAs的研究

2.1.1拟南芥近年来，植物中的大多数lncRNAs都发现于拟南芥。开花抑制基因FLC(FloweringlocusC)能抑制植物开花基因表达，在春化过程中可诱导该基因产生2个lncRNAs：冷协助内含子区非编码RNA (Cold Assisted Intronic Noncoding RNA, COLDAIR)和冷诱导反义RNA (Cool Induced Antisense Intragenic RNA, COOLAIR)，COLDAIR在春化开始后的低温环境下表达水平持续上升，而COOLAIR则在春化初期表达量就迅速升高，这2条lncRNAs已被证实可在春化过程中招募甲基转移酶到FLC，抑制FLC的表达，从而调控光周期表达影响开花时间[41-42]。对拟南芥进行干旱、寒冷、高盐或脱落酸等处理后，相比于对照，有1 832个lncRNAs 的表达量发生了显著改变，甚至上调22倍左右，说明lncRNAs是植物非生物胁迫响应中重要的调节因子，使植物能够适应不同环境[43]。构建拟南芥lncRNA-AT5NCO56820 (Arabidopsisthaliana5NCO56820 )过表达载体，在干旱胁迫下lncRNA-AT5NCO56820可提高拟南芥的耐旱性，表明它可能参与调控了植物抗旱性分子机制[44]。李景睿等[45]利用高通量测序数据定义了1 353个lncRNAs，它们比mRNA的表达量低、内含子少、转录本短；部分lncRNAs还具有组织表达特异性，约10% lncRNAs可与组蛋白及其邻近基因相互作用。2012年，Liu等[43]确定了拟南芥中与病原相关因子诱导防御反应相关因子elf18(elongation factor Tu)的1个lncRNA。2017年，SEO 等[46-47]用丁香假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)DC3000侵染不同处理的植株，发现ELENA1(ELF18-INDUCED LONG-NONCODING RNA1)表达极低的植物对病原菌是敏感的且相关基因PR1(PATHOGENESIS-RELATED GENE1) 表达降低，而用elf18处理后的ELENA1过表达植株不仅提高了PR1表达也显示出病原体抗性表型，表明ELENA1的表达水平参与了拟南芥免疫过程，可能在植物先天免疫过程中起到了转录调控的作用。

2.1.2水稻目前水稻中最具代表性的研究是光敏性雄性不育系“农垦58S”。张启发团队已发现一个与雄性不育性状密切相关的lncRNA—LDMAR (Long-day-specific Male-fertility-associated lncRNA)，长1 236 nt，与光照时间长短有关[48]。植物需在长日照下转录足够多的LDMAR产物，花粉才能正常生长发育，但由于在相关酶作用下，LDMAR产生的短链且有功能的siRNAs，通过RNA介导的DNA甲基化途径使LDMAR启动子区甲基化水平提高，导致LDMAR的转录量降低，使正处于发育的花药提前程序化死亡，造成水稻光敏雄性不育[48]。

2.2 在其他植物中lncRNAs研究

2.2.1玉米从玉米自交系B73顶端分生组织RNA-Seq数据中获得了6 122条lncRNAs，平均长度619 bp且表达量相对较低，进一步对lncRNAs全基因组定位分析，发现6 103条定位在已知的染色体区域，19个定位于未知区域，而2 431个lncRNAs定位在已注释的基因区域，3 691个lncRNAs则定位在已注释的基因区域外[49]。牛旭龙等[50]通过苗期和大田试验筛选出了耐低磷(B73)和磷敏感型(C531)玉米自交系新品种，Zmlnc088和Zmlnc077表达量分别均在B73中先上升后降低、在C531中变化不明显，而Zmlnc333表达量在B73、C531中总体呈下降趋势；3条lncRNAs(Zmlnc088、Zmlnc077、Zmlnc333)在B73根中的表达量受低磷胁迫诱导，而在C531则不受低磷胁迫诱导，表明3个lncRNAs可能参与了玉米低磷胁迫响应机制。玉米中也发现一种花粉特异性表达的lncRNA(Zm401)，长度为1 149 nt，可通过调控花药发育中的关键基因影响花粉粒发育，Zm401表达降低会造成玉米雄性不育[51]。

2.2.2小麦与拟南芥lncRNAs响应胁迫机制相似，小麦中鉴定出的125个lncRNAs参与白粉菌感染和热胁迫响应[52]。束永骏等[53]基于小麦全长cDNA建立了识别lncRNAs的程序，从6 162条全长cDNA中选出了231条lncRNAs；结合RNA的折叠，发现2条lncRNAs可折叠成茎环结构，加工可形成相应的miRNA；进一步进行序列富集分析，发现有3条lncRNAs都富含GC特异调控元件：CCGCCWC、CCRGCCGK和CGTCGYGC，可能与其他分子如蛋白质、DNA等相互作用调节小麦生长发育的过程。在小麦基因组中确定了44 698条lncRNAs，均匀分布于各染色体且有组织发育阶段特异性，有7 743条被基因注释；进行非生物胁迫处理如干旱、盐胁迫、热等，大约29% lncRNAs的表达量在干旱、热胁迫下增加，而盐胁迫下影响了31% lncRNAs的表达，说明它们可能与光合作用、各种生物及非生物胁迫应激反应、其他生物过程有关:如ABA (abscisic acid)的生物合成[54]。

2.2.3棉花基于lncRNAs的组织表达特异性，根据前期所得的茎尖转录组测序数据，利用CPC(coding potential calculator)方法鉴定出8 044条lncRNAs与棉花茎尖组织发育相关，平均长度为694 bp左右；通过基因组共定位方法对蛋白编码基因上下游2 kb内的1 875条lncRNAs进行功能注释，发现：279条参与代谢过程，174条与分子运输相关，44条参与转录调节，49条参与激素应答与信号转导，推测这些lncRNAs可能参与茎尖分生组织中基因的转录调节、代谢、激素应答和信号转导等生物过程[55]。Lu等[56]对棉花进行3个环境处理(对照、干旱及干旱后又复水)，共得到了10 820条lncRNAs，它们的表达水平都较低且ORF较短；对棉花幼苗进行上述3种不同方式的处理后，干旱处理的幼苗子叶变软，而对照组的仍处于正常状态，但对干旱后的幼苗重新浇水后子叶又恢复正常状态；基于对其处理后的RNA-seq数据分析及RT-PCR，与对照组进行比较，干旱处理和重新浇水后分别有3 301条、3 397条lncRNAs的表达上调，而一旦干旱胁迫被移除，表达水平恢复正常；根据富集差异表达分析，分别有9、247、20、28条lncRNAs与乙烯(ETH)、生长素(IAA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)的顺式作用元件相联系，这些lncRNAs可能通过调节植物激素信号通路参与干旱胁迫的响应。

2.2.4白菜大白菜中存在1个调节花粉发育和雄蕊育性的lncRNA-BcMF11，长828 nt，在整个花粉发育阶段均表达，其表达降低时，对营养生长阶段无任何影响，但会造成花粉粒无法成熟，可能参与调节生殖发育过程[57-58]。从白菜“矮脚黄”核不育两用系“Bcajh97-01A/B”不同发育阶段的花蕾及授粉后不同时间的雌蕊中筛选出了12 051条lncRNAs，98%以上的lncRNAs长度在1 000 nt之内，且在染色体上均匀分布；表达量相对较低，有16%的lncRNAs与组织发育进程的表达有关；有144个lncRNAs与706个靶基因存在共表达关系，基于基因功能注释，18个lncRNAs与花及花粉发育相关，可能调控白菜花粉发育及授粉受精的过程[59]。对不结球大白菜进行冷、热胁迫处理(-4 ℃、0 ℃、4 ℃及44 ℃)，基于其RNA-seq数据，10 001条lncRNAs被鉴定出且有9 687条属于新的lncRNAs；在冷、热胁迫下，分别有67、192个靶基因被lncRNAs调节且两者有几个相同的靶基因，表明它们在冷胁迫、热应激处理之间有串扰[60]。

2.2.5番茄目前lncRNAs功能在肉质果实成熟过程中研究较少，在野生番茄和突变型番茄中发现了3 679条lncRNAs，均匀分布于各染色体，与野生番茄相比，突变体中有490条lncRNAs的表达明显上调、187条下调；在果实成熟阶段，lncRNA1459和lncRNA1840被沉默，明显延迟了果实的成熟，表明它们可能参与了调控番茄果实成熟的过程[61]。王昕[62]利用栽培番茄(Heinz1706)和醋栗番茄(LA1589)多个组织的转录组数据，分别鉴定出413和709个lncRNAs；通过比较lncRNAs的相对表达水平和序列差异，发现lncRNAs的表达水平低且保守性差；根据不同组织中的表达水平，2种番茄中的部分lncRNAs具有强烈的组织特异性，特别是在生殖器官，结果有助于进一步研究植物lncRNAs及其调控功能。

2.2.6向日葵分析野生型和栽培型向日葵的体细胞转录组发现，差异表达的基因有29 469个，13 321个为lncRNAs；相比于体细胞，减数分裂期转录组中lncRNAs比例更高，且有6 895条lncRNAs的保守性更高、差异表达的程度更大、与小RNA相似比例更高，表明它们可能参与染色质修饰过程，在植物减数分裂过程中具有重要角色[63]。

2.2.7猕猴桃对猕猴桃“红阳”果实发育的3个阶段：不成熟期、成熟期及采后成熟期的转录组进行测序，鉴定出7 051条lncRNAs；比较其基因表达谱、糖、有机酸及主要氨基酸含量，发现5 931个差异表达基因，表明这些基因可能与糖代谢、有机酸及主要氨基酸代谢有关，为今后深入研究猕猴桃果实的发育、成熟提供了理论基础[64]。

2.2.8野草莓从二倍体野草莓的35个不同的花和果实的组织中确定了5 884条特异表达的lncRNAs，保守性较弱，有1/4左右是hc-lncRNAs(high-confidence lncRNAs)；基于lncRNA与PC(protein-coding)两者的表达，鉴定出两者之间存在正或负相关的表达模式，可能对草莓花和果实的发育有潜在的作用[65]。

2.2.9杨树从胡杨针形和宽卵圆形叶的RNA-Seq测序数据中鉴定出3 013个差异表达的lncRNAs，它们与调节叶片长度和宽度相关基因的表达密切相关，说明在胡杨异形叶形成的过程中起着重要的调控作用[66]。白毛杨的PtoNERD(PopulustomentosaNeeded for RDR2-independent DNA methylation)基因与其启动子部分重叠的假定调节器(NERDL,NERD-related lncRNA)之间的相互作用，对其8个组织中的表达进行上位分析，表明NERDL与PtoNERD之间存在相对较强的正相关，且在次生组织中的表达高于原生组织，它们可能参与了树木次生木质部的形成过程[67]。

2.2.10衣藻对莱茵衣藻 (Chlamydomonasreinhardtii) lncRNA进行全基因组筛选与鉴定，缺硫胁迫处理后，对照组与实验组共筛选出1 440个 lncRNAs，平均长度在509 nt左右，均匀分布于各染色体；表达水平较低且长度、外显子个数及ORF都较少；在光合作用过程中，lncRNAs对PSⅡ (photosystemⅡ)的基因具有调控功能：XLOC_037917，XLOC_037244，XLOC_037246 这3个差异表达的lncRNAs共同调控LHCBM2(Ligh-Harvesting Complexes 2)和LHCBM7两个靶基因，且当XLOC_037917、XLOC_037246表达量下降或XLOC_037244表达量升高时均可降低靶基因的表达量，有利于氢气的产生，说明这些lncRNAs可能参与光合作用并在调控氢气产生的过程中起着不可忽视的作用[68]。

3 展 望

随着高通量测序技术的飞速发展，各种生物种中大量的lncRNAs被挖掘，虽在某些生物中其功能和作用机制已有研究，但由于其复杂及多样性的结构特征使其研究仍处于表面，而且在植物中研究仍处于探索的初步阶段，很多问题亟待解决。目前lncRNAs的命名没有统一标准，不宜对其进行研究归类；虽已有有关lncRNAs的数据库，但还是不足以支撑更深入的研究，尤其在植物方面；lncRNAs的研究领域较局限，目前主要集中于动物和人类疾病研究；lncRNAs的研究已逐步成为热点，但目前可用的新技术较少，且方法、策略也不够完善。在未来研究中，要针对不同的问题采取相应措施：根据其综合特征来规定一个国际通用命名的原则和方法；不断更新和完善lncRNAs的数据库，尤其在植物方面，使其更方便、准确地深入研究lncRNAs的功能；要不断尝试与创新，提出新的研究方法与技术等。

近年来，虽然lncRNAs的研究已取得很好的成果，但由于研究方法等使其研究领域较局限、结构与功能之间的相关性未能作出深入研究。因此，技术和方法的快速发展将给 lncRNA s研究带来新的转机和突破，lncRNAs在植物中生物学功能及作用机制将会成为研究的热点。

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