不同浓度西红花苷对RANKL诱导的小鼠破骨细胞分化的影响

林思思，章礼炜，孙旺，施更生△

牙周炎主要是由局部因素引起的牙周支持组织的慢性炎症，是最常见的口腔疾病之一，在世界范围内有较高的患病率［1-3］。牙周炎是造成牙齿过早脱落的首要原因，其中以牙龈炎症、牙周袋形成、附着丧失、牙槽骨吸收为主要临床症状［4-5］，但目前牙周炎的研究主要以抑制牙菌斑、减少炎症为主，而针对抑制骨吸收的研究较少。西红花苷又称西红花素，是从我国中药藏红花中提取出来的，是西红花的一种水溶性类胡萝卜素类化合物西红花酸与不同糖结合而成的一系列酯苷［6］。随着近年来国内外对西红花苷研究的逐渐深入，发现西红花苷能够减少骨关节炎动物模型的骨退化［7］。然而，西红花苷对破骨细胞的直接影响还未被研究清楚，因此本文研究不同浓度的西红花苷对核因子κB受体激动剂配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）诱导的破骨细胞生成的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 RAW264.7小鼠巨噬细胞购自恩泽医疗集团公共科研平台，西红花苷、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒购于Sigma公司，西红花苷采用去离子水稀释至储存浓度（40 mmol/L），青-链霉素溶液（100×）、CCK-8试剂盒购于碧云天生物科技有限公司，RANKL购于R&D systems，α-MEM培养基、胎牛血清、DMEM均购于Gibco公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit购自美国Fermentas公司，FS SYBR Green Master购自上海Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将小鼠巨噬细胞RAW264.7在含10%胎牛血清、1%青-链霉素的α-MEM培养基中常规培养，当细胞融合度至70%～80%时，胰酶消化后按1∶2进行传代。

1.2.2 CCK-8法检测不同浓度的西红花苷对细胞生长活力的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板，分别取 0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 µmol/L 的西红花苷加入细胞培养基中，每个浓度设3个复孔，37℃分别孵育48、96 h后，弃上清，按每孔加入5µL CCK-8试剂和95µL DMEM培养基，37℃培养箱孵育2 h后，用Tecan酶标仪检测各组细胞450 nm处的吸光度。

1.2.3 TRAP染色成熟的破骨细胞 RAW264.7细胞以4×103个/孔接种于48孔板，37℃培养箱过夜，加入100 ng/L RANKL 和 0、12.5、50、100µmol/L 的西红花苷进行诱导，每2 d换液1次，第6天用TRAP染色，细胞用4%多聚甲醛固定20 min，在含有萘酚AS-BI磷酸盐的孵育液中37℃孵育1 h，用去离子水反复冲洗3次，苏木精复染3 min，PBS冲洗3次，100倍显微镜下观察细胞染色情况并对破骨细胞进行计数，TRAP阳性细胞染色呈紫色，有3个细胞核以上的巨噬细胞即为成熟破骨细胞。

1.2.4 实时荧光定量PCR RAW264.7细胞以1×105个/孔接种于 6 孔板，加入 100 ng/L RANKL 和 0、12.5、50、100µmol/L的西红花苷进行诱导，直至0µmol/L组观察到破骨细胞形成。收集细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA后进行real-time PCR反应。20µL反应体系包含cDNA模板1µL，上、下游引物各0.25µL，ddH2O 8.5µL，SYBR Green 10µL。反应条件：50℃预变性 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。每个样品均设3个复孔，在实时荧光定量仪ABI 7500上进行，以GADPH为内参，采用2-ΔΔCt法分析破骨细胞特异性基因降钙素受体（CTR）、活化 T 细胞核因子 1（NFATC1）、C-fos、TRAP的mRNA表达水平，相应的引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

Tab.1 Primers for qRT-PCR表1qRT-PCR引物序列表

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 西红花苷对细胞活性的影响 CCK-8检测结果显示，在 0～100µmol/L范围内，西红花苷对RAW264.7细胞的生长无明显影响。当西红花苷浓度≥100µmol/L时，细胞增殖活力下降，显示出明显的抑制增殖作用，见图1。后续实验选取0～100µmol/L西红花苷进行实验。

2.2 西红花苷对RANKL诱导的RAW264.7形成破骨细胞的影响 TRAP染色可观察到西红花苷的浓度越高，TRAP染色阳性细胞越少，抑制RAW264.7细胞形成破骨细胞的作用越明显，见图2。

2.3 荧光实时定量PCR结果 随着西红花苷浓度的升高，破骨细胞中 CTR、NFATC1、C-fos、TRAP 的mRNA表达水平逐渐降低，见图3。

3 讨论

牙周病指发生在牙龈、牙周膜等牙齿支持组织的慢性炎症性疾病［8］，由于其周期较长，牙周组织的反复炎症可以造成附着丧失和牙槽骨的吸收［9］，当牙龈中的慢性炎症向深部牙周组织扩展到牙槽骨附近时，骨表面和骨髓腔内分化出破骨细胞和单核-巨噬细胞，发生陷窝状骨吸收，或使骨小梁变细，骨髓腔增大，破骨细胞和单核细胞是与骨吸收相关的两种细胞部分。牙槽骨吸收是牙周炎的一个主要病理变化，由于牙槽骨的吸收，使牙齿的支持组织丧失，牙齿早期脱落，并且可以造成缺牙区牙槽骨宽度不够、上颌窦底较低、下牙槽神经管较近等问题，不利于后期缺牙区种植修复。牙周炎的发病机制目前尚未明确，但是目前研究已知牙菌斑微生物是引起牙周炎的重要因素［10］。牙菌斑微生物可以引起牙龈炎症，而宿主免疫炎症反应在对抗细菌感染时产生的基质金属蛋白酶、致炎因子、前列腺素等炎症介质是导致牙周组织破坏的主要因素［11-13］。而目前治疗牙周炎的药物大多都是针对抑制炎症介质，较少研究抑制骨吸收的药物。因此，本文选用研究药物抑制骨吸收具有一定的创新性。

Fig.1 The effects of 0-400µmol/L of crocin on the viability of RAW264.7 cells图1 0～400µmol/L西红花苷对RAW264.7细胞生长活力的影响

Fig.2 The effects of different concentrations of crocin on receptor activator of RANKL-induced osteoclastogenesis图2 不同浓度西红花苷对RANKL诱导形成破骨细胞的影响

Fig.3 The effects of different concentrations of crocin on expression levels of TRAP,CTR,NFATC1 and C-fos mRNA图3 不同浓度西红花苷对破骨细胞TRAP、CTR、NFATC1、C-fos mRNA表达的影响

西红花又称藏红花，是一种鸢尾科番红花属的多生花卉，其药用部位为西红花的干燥柱头，是我国传统中药材。西红花苷是西红花中提取物之一，主要存在于西红花中的非四萜类色素，包括西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3、西红花苷-4和西红花酸，均是胡萝卜烯类化合物在植物体内的氧化产物［14］。近几年研究表明，西红花苷具有明显的抗肿瘤、保护心血管的功效［15-16］。Hire 等［15］发现西红花苷可以通过抑制细胞的有丝分裂从而抑制乳腺癌细胞的增殖。Ghorbanzadeh等［16］研究发现，西红花苷可以通过提高miR-126和miR-210的表达、激活蛋白激酶B（Akt）和细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）信号通路而促进大鼠心脏血管生成，预防心血管疾病的发生。随着对西红花苷研究的逐渐深入，Hemshekhar等［7］发现西红花苷可以通过调节基质金属蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、MMP-9、透明质酸酶和非酶类如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1b、NF-κB等水平和改善抗氧化能力而缓解小鼠软骨和骨退化。国内Cao等［17］发现西红花苷可通过抑制无机矿物质的流失，而减少骨质疏松的发生，同时西红花苷浓度越高，抑制破骨细胞形成的效果越明显。因此本研究将不同浓度（0～400µmol/L）的西红花苷加入RAW264.7细胞中，用CCK-8实验筛选出适宜的西红花苷实验浓度，然后在一定浓度内（0～100µmol/L）证实了西红花苷的浓度越高，RAW264.7细胞诱导分化成破骨细胞的数量越少，同时破骨细胞的特异性基因CTR、NFATC1、C-fos、TRAP mRNA表达量越少，提示在一定浓度范围内，西红花苷浓度越高，抑制破骨细胞形成的效果越明显。本研究为西红花苷用于牙周炎的研究提供了实验依据，今后应进一步观察西红花苷对成骨细胞的影响及机制。

［1］Hong JW，Noh JH，Kim DJ.The Prevalence and associated factors of periodontitis according to fasting plasma glucose in the korean adults：The 2012-2013 Korea National Health and Nutrition Examination Survey［J］.Medicine（Baltimore），2016，95（14）：e3226.doi：10.1097/MD.0000000000003226.

［2］Eke PI，Dye BA，Wei L，et al.Update on prevalence of periodontitis in adults in the United States：NHANES 2009 to 2012［J］.J Periodontol，2015，86（5）：611-622.doi：10.1902/jop.2015.140520.

［3］Zhang Q，Li ZX，Wang CX，et al.Prevalence and predictors for periodontitis among adults in China，2010［J］.Global Health Action，2014，7：24503.doi：10.3402/gha.v7.24503.

［4］Hajishengallis G.Periodontitis：from microbial immune subversion to systemic inflammation［J］.Nat Rev Immunol，2015，15（1）：30-44.doi：10.1038/nri3785.

［5］Mariotti A，Hefti AF.Defining periodontal health［J］.BMC Oral Health，2015，15（Suppl 1）：S6.doi：10.1186/1472-6831-15-S1-S6.

［6］Alavizadeh SH，Hosseinzadeh H.Bioactivity assessment and toxicity of crocin：a comprehensive review［J］.Food Chem Toxicol，2014，64：65-80.doi：10.1016/j.fct.2013.11.016.

［7］Hemshekhar M，Sebastin SM，Sunitha K，et al.A dietary colorant crocin mitigates arthritis and associated secondary complications by modulating cartilage deteriorating enzymes，inflammatory mediators and antioxidant status［J］.Biochimie，2012，94（12）：2723-2733.doi：10.1016/j.biochi.2012.08.013.

［8］Highfied J.Diagnosis and classification of periodontal disease［J］.Aust Dent J，2009，54（Suppl 1）：S11-26.doi：10.1111/j.1834-7819.2009.01140.x.

［9］Lindberg TY，Båge T.Inflammatory mediators in the pathogenesis of periodontitis［J］.Expert Rev Mol Med，2013，15：e7.doi：10.1017/erm.2013.8.

［10］Albandar JM.Global risk factors and risk indicators for periodontal diseases［J］.Periodontology，2000，29：177-206.doi：10.1034/j.1600-0757.2002.290109.x.

［11］Silosi I，Cojocaru M，Foia L，et al.Significance of circulating and crevicular matrix metalloproteinase-9 in rheumatoid arthritischronic periodontitis association［J］.J Immunol Res，2015，2015：218060.doi：10.1155/2015/218060.

［12］Boström EA，Kindstedt E，Sulniute R，et al.Increased eotaxin and MCP-1 levels in serum from individuals with periodontitis and in human gingival fibroblasts exposed to pro-inflammatory cytokines［J］.PLoS One，2015，10（8）：e0134608.doi：10.1371/journal.pone.0134608.

［13］Trindade F，Oppenheim FG，Helmerhorst EJ，et al.Uncovering the molecular networks in periodontitis［J］.Proteomics Clin Appl，2014，8（9/10）：748-761.doi：10.1002/prca.201400028.

［14］Inoue E，Shimizu Y，Masui R，et al.Effects of saffron and its constituents，crocin-1，crocin-2，and crocetin on α -synuclein fibrils［J］.J Nat Med，2018,72（1）:274-279.doi：10.1007/s11418-017-1150-1.

［15］Hire RR，Srivastava S，Davis MB，et al.Antiproliferative activity of crocin involves targeting of microtubules in breast cancer cells［J］.Sci Rep，2017，7：44984.doi：10.1038/srep44984.

［16］Ghorbanzadeh V，MohammadiM，Dariushnejad H，etal.Cardioprotective effect of crocin combined with voluntary exercise in rat：role of Mir-126 and Mir-210 in heart angiogenesis［J］.Arq Bras Cardiol，2017，109（1）：54-62.doi：10.5935/abc.20170087.

［17］Cao PC，Xiao WX，Yan YB，et al.Preventive effect of crocin on osteoporosis in an ovariectomized rat model［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014：815181.doi：10.1155/2014/825181.