Nrf2-自噬通路在大鼠切口痛-瑞芬太尼诱导痛觉过敏中的作用

顾喜燕，王志宏，于泳浩

诱导术后痛觉过敏可增加阿片药物用量并导致术后持续疼痛，该问题一直是瑞芬太尼临床应用的一大困扰［1］，但具体机制并不完全明确。自噬通常作为一种保护性细胞代谢途径也参与神经痛的发生发展［2］，而且自噬与体内氧化应激反应关系密切［3］。核因子 E2相关因子 2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）在应激状态下可磷酸化入核，启动抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE），增加其下游抗氧化蛋白基因及相关酶的表达，是公认的抗氧化应激的重要枢纽分子［4-5］。目前在瑞芬太尼诱导的痛觉过敏中，上述因子的表达变化鲜有研究报道。本研究旨在初步探讨Nrf2在切口痛-瑞芬太尼痛敏大鼠模型中的表达变化及其与自噬、痛敏行为学的关系，为瑞芬太尼的术后痛觉过敏机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 雄性清洁级SD大鼠24只，2～2.5月龄，体质量250～300 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。主要试剂：盐酸瑞芬太尼（瑞捷，1 mg）购自宜昌人福药业有限责任公司，用前以生理盐水稀释至10 mg/L；Nrf2激动剂叔丁基对苯二酚（tBHQ）购自美国MCE公司；抗Beclin-1单克隆抗体、抗LC3Ⅱ单克隆抗体、抗Nrf2单克隆抗体、抗HO-1单克隆抗体均购自Abcam公司；抗β-actin单克隆抗体购自北京华安麦科生物技术有限公司。YLS-6B智能热板仪购自淮北正华生物仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 24只大鼠随机数字表法分为3组：生理盐水+切口痛组（I组）、切口痛-瑞芬太尼痛敏组（RI组）、Nrf2激动剂组（t-BHQ组），每组8只。I组和RI组建模前分别经尾静脉输注生理盐水0.1 mL/（kg·min）和瑞芬太尼1µg/（kg·min），连续输注60 min。输注同时于双侧后足建立Brennan切口痛模型。t-BHQ组于输注瑞芬太尼前0.5 h开始给予腹腔注射Nrf2激动剂t-BHQ 15 mg/kg，12 h 1次，连续4次，余处理同RI组。

1.2.2 切口痛模型建立 大鼠置于50 cm×30 cm×20 cm密闭木箱中吸入七氟醚至不能站立后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠。于鼠尾中下1/3处穿刺留置24号静脉留置针，医用胶带固定并以少许生理盐水封管。按原定方案静脉输注生理盐水或瑞芬太尼。输注同时大鼠双侧后足底消毒后于其后缘正中0.5 cm处向前纵行切开皮肤及筋膜（约1 cm），以眼科镊挑起跖肌，纵行充分剥离，过程中要注意保持肌肉起止附着点完整。按压止血后缝合切口，对合皮肤使其不得重叠、内翻或裂开。碘伏消毒切口后涂少量红霉素软膏预防感染。

1.2.3 行为学测定 静脉输注前24 h（T0），输注结束后2 h（T1）、6 h（T2）、24 h（T3）和 48 h（T4）测定动物行为学变化，包括机械缩足反应阈值（PWT）和热缩足潜伏期（PWL）。测定环境：室温（18～22℃）、安静，测定前实验鼠先适应环境30 min。采用BSEVF3电子Von Frey纤维丝测定PWT，将大鼠置于有小网孔，底部悬空放置的金属笼内，以Von Frey纤维丝对准右后足第2、3趾间距离切口边缘约1 cm处垂直施压，大鼠出现快速缩足、舔足或嘶叫时停止加压并记录该压力值。测定间隔为5 min，共测定5次，去除最大值和最小值，取平均值记录为PWT值，最大压力设定为60 g，增至此压力无反应者剔除。YLS-6B智能热板仪测定大鼠右后足PWL，热板设为恒温50℃，记录大鼠右后足开始接触热板至出现回缩、踮脚、挣扎、嘶叫、舐足任一反应的时间，连续测5次，间隔5 min，去除最大值和最小值，取平均值记为PWL值。PWL上限定为30 s，超过30 s无反应者剔除。

1.2.4 脊髓组织Nrf2-自噬通路相关蛋白测定 行为学测试完毕后处死实验大鼠，取L4～6脊髓组织，保存于-80℃。Western blot法检测脊髓 LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2和HO-1蛋白表达。冰浴下加入组织蛋白裂解液，研磨脊髓样本成组织匀浆并提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。取15µg蛋白样品，沸水（100℃）煮10 min后迅速冷却，10%SDS-PAGE电泳后，将目的蛋白转至PVDF膜上（恒压100 V，60 min），5%脱脂奶粉封闭 1 h，加入一抗 LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2、HO-1 和内参 β-actin（抗体稀释度均为 1∶1 000），4 ℃孵育过夜，次日经30 min复温后加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗（1∶5 000），常温孵育1 h，暗室内加入显色剂，曝光扫描。用Quantity One测定条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与βactin条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达量变化。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用重复测量资料的方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痛敏行为学变化 随着处理时间的延长，3组PWT、PWL呈总体下降的趋势（均P＜0.01）。组间比较结果显示，T1时点开始，与I组相比，RI组PWT下降、PWL缩短（P＜0.05）；此时，tBHQ组较RI组PWT升高、PWL延长（P＜0.05），见表1、2。

2.2 Nrf2-自噬通路相关蛋白表达变化 与I组比较，RI组 LC3Ⅱ、Beclin-1 表达升高，Nrf2、HO-1 蛋白表达下降（P＜0.05）。而相比 RI组，t-BHQ组Nrf2、HO-1、LC3Ⅱ、Beclin-1 蛋白表达均明显升高（P＜0.05），见图 1、表 3。

Tab.1 Comparison of PWT at different time points between three groups表1 3组大鼠不同时间点PWT比较 （n=8，g，±s）

Tab.1 Comparison of PWT at different time points between three groups表1 3组大鼠不同时间点PWT比较 （n=8，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F 组间=6.25，F 时间=644.21，F 交互=4.10，均 P＜0.05；组内不同时间比较：A与 T0比较，B与 T1比较，C与 T2比较，P＜0.05；组间比较：a与I组比较，b与RI组比较，P＜0.05

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Tab.2 Comparison of PWL at different time points between three groups表2 3组大鼠不同时点PWL的比较 （n=8，s，±s）

Tab.2 Comparison of PWL at different time points between three groups表2 3组大鼠不同时点PWL的比较 （n=8，s，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F 组间=5.05，F 时间=3 862.44，F 交互=25.66，均 P ＜ 0.05；组内不同时间比较：A与 T0比较，B与 T1比较，C与 T2比较，P＜0.05；组间比较：a与I组比较，b与RI组比较，P＜0.05

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Fig.1 Western blot results of proteins in the Nrf2–autophagy pathways in spinal cord tissues between three groups图1 3组大鼠脊髓组织Nrf2-自噬通路相关蛋白Western blot结果

Tab.3 Comparison of spinal LC3Ⅱ,Beclin-1,Nrf2 and HO-1 at T4between three groups表3 3组大鼠脊髓LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2和HO-1 T4时表达的比较 （n=8，±s）

Tab.3 Comparison of spinal LC3Ⅱ,Beclin-1,Nrf2 and HO-1 at T4between three groups表3 3组大鼠脊髓LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2和HO-1 T4时表达的比较 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a与 I组比较，b与 RI组比较，P＜0.05，tBHQ 组与 I组不进行比较

组别I组RI组tBHQ组F LC3Ⅱ0.42±0.04 0.86±0.08a 1.14±0.05b 269.41＊＊Beclin-1 0.31±0.03 0.72±0.09a 1.01±0.05b 238.36＊＊Nrf2 0.30±0.05 0.19±0.03a 0.42±0.04b 51.84＊＊HO-1 0.25±0.03 0.17±0.04a 0.35±0.03b 50.53＊＊

3 讨论

阿片类药物诱导痛觉过敏是应用阿片类药物镇痛过程中出现疼痛感矛盾性增加的一种现象，但目前机制并不完全清楚［6］。目前，瑞芬太尼作为短效阿片类药物广泛应用于临床麻醉。而诱发术后切口痛敏是瑞芬太尼临床应用的一个主要问题。

在阿片类制剂诱导痛敏的机制研究中，常测量用药前后或干预因素处理前后对伤害性刺激的回避反射（甩尾、缩足等）的变化来评估其对实验动物痛阈的影响。由于刺激强度急剧变化的伤害性刺激（如热辐射甩尾实验）可以掩盖基线伤害感受阈值的变化，而缩爪试验的缓慢上升刺激曲线（PWT、PWL）克服了这一影响，甚至可以测得基线感受阈值的细微变化，所以被临床前研究广泛应用［7］。自噬通过选择性或非选择性分解再利用多余的或结构异常的大分子或细胞结构来改善细胞功能、提高细胞生存率，是一种重要的物质代谢方式及保护机制。自噬与多种机体应激反应下的适应反应和修复过程有着复杂的关系网［8］，自噬功能异常影响着机体内包括炎症反应［9］、疼痛过程［2］在内的多种生理病理过程，调节自噬水平适度活跃对细胞代谢显得尤为重要。Beclin-1、LC3Ⅱ是自噬体形成的起始阶段和膜延伸阶段的重要蛋白，也是检测自噬水平最常用的自噬相关蛋白［10-11］。Nrf2不仅被认为是抗氧化应激的中枢调节者，同时是多种自噬凋亡基因的转录因子［4］并参与自噬的调节［12］。故笔者选定了Nrf2及其下游效应分子HO-1作为研究观察蛋白。

参照本课题组的前期研究成果［13］，本研究成功建立了经典切口痛-瑞芬太尼痛敏大鼠模型。与I组相比，从输注结束后2 h（T1）开始，RI组PWT下降、PWL时间明显缩短，痛敏现象明显加重。在T4时RI组大鼠脊髓腰膨大组织内自噬相关蛋白（LC3Ⅱ、Beclin-1）表达明显增加、Nrf2及其下游蛋白HO-1表达下调，提示瑞芬太尼致切口痛痛敏现象可能与自噬及Nrf2信号通路活性改变有关。虽然此前尚无阿片制剂所致痛敏与脊髓内自噬基础活性及相关自噬通路关系的报道，但已有文献证实，不同神经痛痛敏模型中［脊神经结扎模型（SNL）、慢性压迫性坐骨神经损伤模型（CCI）和坐骨神经保留分支损伤模型（SNI）］脊髓自噬相关蛋白调节各有不同，而蛛网膜下腔注射氯喹抑制脊髓自噬后实验大鼠PWT明显降低［2］，提示脊髓自噬与脊髓水平疼痛机制相关。相比于RI组，给予t-BHQ后大鼠PWT升高、PWL 延长，LC3Ⅱ、Beclin-1、Nrf2 总蛋白和 HO-1蛋白表达明显增加，提示t-BHQ可以改善瑞芬太尼痛敏大鼠模型的痛敏行为学并增加脊髓自噬活性，而Nrf2-HO-1信号通路可能通过调节模型中大鼠脊髓自噬水平参与痛敏的调节。结果提示维持脊髓水平适度自噬活性有利于对痛敏的控制，与文献［2］抑制自噬恶化机械性痛敏的结果一致。

综上所述，切口痛-瑞芬太尼痛敏大鼠模型中脊髓自噬活性及Nrf2蛋白表达较对照组均有所改变，而Nrf2-HO-1信号通路可能通过调节脊髓自噬参与调节了大鼠切口痛-瑞芬太尼诱导的痛敏反应。

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