夏枯草硫酸多糖对四氯化碳致大鼠肝纤维化的干预作用

付月月，张双霞，张国梁

肝纤维化是肝硬化发生的前奏和必经的中间环节，是一种严重威胁人类健康的常见疾病［1-2］。慢性肝病大多数都有肝纤维化，其中20%～40%最终发展成为肝硬化甚至肝癌［3］。迄今为止，肝纤维化发生发展的机制尚未完全明确，因此寻找和探索治疗肝纤维化的有效途径对防治肝硬化和肝癌有重要意义。夏枯草作为一种唇形科的传统中药，主要包括总三萜类、黄酮类、多糖类等生物活性成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等多种作用［4-7］。研究表明其在治疗肝纤维化上有重要意义［8-9］。夏枯草硫酸多糖（Prunella vulgaris sulfated polysaccharide，PVSP）是夏枯草主要的生物活性成分之一，具有调节免疫、抗炎、抗肿瘤等作用。本研究采用PVSP作用于四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化模型大鼠，观察PVSP对肝纤维化的干预作用，初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂PVSP（天津医科大学药学院），CCl4（天津富宇精细化工有限公司），Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）引物（Genwiz，北京），Col-Ⅰ和 α-SMA、GAPDH抗体（Abcam，美国），免疫组化二抗、天狼猩红染色试剂盒、山羊血清（Boster，武汉），逆转录试剂盒（Takara，日本）。

1.2 实验动物 5～6周龄雄性SD大鼠，60只，SPF级，体质量180～200 g，购自军事医学科学院实验动物中心，标准鼠食喂养。本研究所有实验动物操作均遵循实验动物伦理条律，并经天津市第一中心医院伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1 肝纤维化模型的制备及分组给药 60只SD大鼠，采用抓阄法取2组大鼠分别为空白对照组（Blank组）和溶剂对照组（Solvent组），每组10只；Blank组不作任何处理，正常喂养；Solvent组腹腔注射1 mL/kg橄榄油溶液，每周2次，共4周；其余大鼠均腹腔注射1 mL/kg 40%CCl4橄榄油溶液，每周2次，共4周。在CCl4造模过程中，共有9只大鼠死亡，采用抓阄法将造模成功的31只大鼠分成3组：模型组（Model组）、PVSP高剂量组（PVSP-H组：400 mg/kg）和PVSP低剂量组（PVSP-L组：100 mg/kg），每组10只，剩余1只用于肝纤维化模型的再次鉴定。Model组、PVSP-H组和PVSP-L组均继续腹腔注射1 mL/kg 40%的CCl4橄榄油溶液，每周2次，PVSP-H组和PVSP-L组每天1次灌胃给药，Blank组和Solvent组给予等量生理盐水，共5周。末次灌胃后禁食24 h，5%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，收集腹主动脉血和肝脏组织。

1.3.2 血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）的测定 大鼠麻醉后，腹主动脉取血，2 000 r/min离心15 min，收集血清，放于-80℃保存。采用全自动生化分析仪测定血清ALT和AST。

1.3.3 肝组织病理学检查 取距离肝右叶同一部位肝组织，4%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片。HE及天狼猩红染色，光学显微镜下观察肝细胞变性、胶原纤维增生程度及组织形态学变化。

1.3.4 qRT-PCR检测Col-Ⅰ和α-SMA mRNA表达 用TRizol法提取肝组织中RNA，取2µg按逆转录试剂盒逆转录成cDNA。PCR引物序列：Col-Ⅰ上游5′-ACAGACCAA⁃CAACCCAAACTC-3′，下游 5′-ACTTATACCCACATAG⁃GTCTTCAAG-3′，253 bp；α-SMA 上游 5′-AAGTATCC⁃GATAGAACACG-3′，下游 5′-TAGATAGGCACGTTGTGAG-3′，296 bp；GAPDH 上游 5′-CCATCAACGACCCCTTCATT-3′，GAPDH 下游 5′-GACCAGCTTCCCATTCTCAG-3′，110 bp。反应条件：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40个循环以后进行熔解曲线分析，2－ΔCt法进行计算。实验重复3次。

1.3.5 免疫组织化学方法检测Col-Ⅰ和α-SMA表达 石蜡切片70℃50 min，脱蜡，水化，柠檬酸盐抗原修复15 min，10% 山羊血清封闭 1 h，一抗（Col-Ⅰ 1∶300，α-SMA 1∶200）4℃孵育过夜，二抗37℃孵育1 h，DAB染色，苏木精复染，脱水，透明，封片，光学显微镜下观察。采用Image-Pro Plus 6.0彩色图像分析软件分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件进行统计分析。计量资料以±s表示，比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清ALT和AST的变化 Solvent组血清ALT、AST与Blank组相比差异无统计学意义。与Blank组相比，Model组血清ALT和AST明显升高（P＜0.05）；PVSP-H 和 PVSP-L组血清 ALT及AST均低于Model组（P＜0.05），其中PVSP-H组较PVSP-L 组更低（P＜0.05），见表 1。

Tab.1 Effects of PVSP on serum levels of ALT and AST表1PVSP对大鼠血清ALT、AST的影响 （n=10，±s）

Tab.1 Effects of PVSP on serum levels of ALT and AST表1PVSP对大鼠血清ALT、AST的影响 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与 Blank 组相比，b与 Solvent组相比，c与 Model组相比，d与 PVSP-H 组相比，P＜0.05；表 2、3 同

组别Blank组Solvent组Model组PVSP-H组PVSP-L组F ALT（U/L）37.97±4.78 40.48±9.56 131.57±17.84ab 56.91±9.27c 65.98±5.24cd 66.617＊＊AST（U/L）135.83±13.62 127.14±11.03 319.07±20.98ab 166.27±25.18c 274.48±25.31cd 93.308＊＊

2.2 各组大鼠肝脏组织病理学的变化 HE及天狼猩红染色结果显示，Blank组和Solvent组肝组织肝小叶与汇管区结构正常，肝细胞呈条索状排列，无明显肝细胞坏死，无间质扩增，纤维主要分布于汇管区和中央静脉周围。Model组大部分肝小叶结构破坏或消失，肝索排列紊乱，可见肝细胞点状坏死，有少量炎性细胞排列，肝细胞空泡变性散在分布，间质增生明显，肝汇管区及肝小叶坏死区可见大量纤维组织增生，纤维间隔形成明显，其界板破坏严重，分割、包绕肝小叶。与Model组相比，PVSP-H及PVSP-L组肝小叶结构稍紊乱，较少肝细胞脂肪变性、炎性细胞浸润，纤维组织轻度增生，汇管区的纤维增生不明显，PVSP-H及PVSP-L组纤维化程度较Model组明显减轻，见图1。

2.3 各组大鼠肝脏组织中Col-Ⅰ和α-SMA mRNA的相对表达量 Solvent组肝组织中Col-Ⅰ、α-SMA mRNA与Blank组比较差异均无统计学意义。与Blank组相比，Model组肝脏组织中Col-Ⅰ和α-SMA mRNA表达量升高（P＜0.05）。与Model组相比，PVSP-H及PVSP-L组肝脏组织中Col-Ⅰ和α-SMA mRNA表达量降低（P＜0.05），其中PVSP-H组较PVSP-L组Col-Ⅰ和α-SMA mRNA表达量更低（P＜0.05），见表 2。

Tab.2 Effects of PVSP on the expressions of Col-Ⅰand α-SMA mRNA in rat hepatic tissues表2 PVSP对大鼠肝脏组织中Col-Ⅰ、α-SMA mRNA表达的影响 （n=10，±s）

Tab.2 Effects of PVSP on the expressions of Col-Ⅰand α-SMA mRNA in rat hepatic tissues表2 PVSP对大鼠肝脏组织中Col-Ⅰ、α-SMA mRNA表达的影响 （n=10，±s）

组别Blank组Solvent组Model组PVSP-H组PVSP-L组F Col-Ⅰ0.67±0.20 0.63±0.27 1.72±0.14ab 0.82±0.07c 1.07±0.25cd 14.655＊＊α-SMA 0.80±0.22 0.79±0.11 1.78±0.16ab 0.81±0.09c 1.32±0.18cd 23.478＊＊

2.4 大鼠肝脏组织中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达情况 免疫组化结果显示，Solvent组肝组织中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白与Blank组差异均无统计学意义。Model组肝组织中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达呈强阳性，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与Model组相比，PVSP-H及PVSP-L组肝脏组织中Col-Ⅰ和α-SMA蛋白表达量降低（P＜0.05），其中 PVSP-H 组较 PVSP-L组 Col-Ⅰ、α-SMA 蛋白表达量更低（P＜0.05），见图 2、3，表 3。

Fig 1 Pathological images of rat hepatic tissues(×100)图1 大鼠肝组织的病理学观察（×100）

Fig.2 Expression of Col-Ⅰ in rat hepatic tissues(IHC staining,×100)图2 大鼠肝组织中Col-Ⅰ的表达（免疫组化染色，×100）

Fig.3 Expression of α-SMA in rat hepatic tissues(IHC staining,×100)图3 大鼠肝组织中α-SMA的表达（免疫组化染色，×100）

Tab.3 Effects of PVSP on the expressions of Col-Ⅰand α-SMA in rat hepatic tissues表3 PVSP对大鼠肝脏组织中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达的影响 （n=10，±s）

Tab.3 Effects of PVSP on the expressions of Col-Ⅰand α-SMA in rat hepatic tissues表3 PVSP对大鼠肝脏组织中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达的影响 （n=10，±s）

组别Blank组Solvent组Model组PVSP-H组PVSP-L组F Col-Ⅰ0.32±0.04 0.30±0.05 0.78±0.09ab 0.42±0.08c 0.58±0.02cd 31.718＊＊α-SMA 0.41±0.07 0.42±0.07 0.98±0.10ab 0.51±0.16c 0.66±0.90cd 16.066＊＊

3 讨论

肝纤维化是肝脏对各种原因所导致的肝损伤的创伤愈合反应，也是各种急慢性肝病共同的病理过程。能够引起肝脏损伤的因素经长期、反复的作用，会导致肝细胞变性、坏死，进而引起肝细胞再生和肝内结缔组织增生，最终导致肝纤维化形成［10］。CCl4导致的大鼠肝纤维化模型是经典的慢性肝损伤模型，其模型的制备具有简便易行和造模成功率高等特点［11］。

血清ALT和AST是反映肝损伤的主要指标，肝细胞一旦受损，ALT和AST会大量释放入血［12］。本研究显示，Model组血清ALT和AST较Blank组显著升高，且明显高于PVSP-H组和PVSP-L组；而PVSP-H组较PVSP-L组降低程度更明显，说明PVSP具有良好的保肝作用，而高剂量的PVSP的作用更明显。HE和天狼猩红染色结果显示，Model组有大量假小叶形成，肝纤维化程度严重；PVSP-H组和PVSP-L组与Model组相比肝纤维化程度较轻，分析其原因可能与PVSP减少肝细胞坏死和抑制胶原纤维的沉积有关。

肝纤维化是肝脏受到损伤因素的持续刺激使得肝脏中胶原蛋白等细胞外基质（ECM）的增生与降解失去平衡，导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程［13］。有研究发现，肝纤维化时肝脏胶原蛋白的含量明显升高，以Col-Ⅰ的升高较为明显［14］，说明Col-Ⅰ是肝纤维化过程中ECM的主要成分，在肝纤维化中发挥着重要作用。肝星状细胞（HSC）属于肝脏间质细胞，在肝纤维化的发生发展中起着决定性的作用；当HSC受到损伤刺激时会发生表型改变，转化为具有增殖能力的肌成纤维细胞，该细胞可向损伤部位迁移并增殖，同时可表达各种信号蛋白；α-SMA蛋白是HSC的标志性蛋白，当HSC活化时，α-SMA蛋白表达异常增加，该蛋白具有收缩功能，是肝纤维化形成的另一重要因素［15-17］。因此，Col-Ⅰ和α-SMA是反映肝纤维化程度的重要指标［18］。qRT-PCR和免疫组化的结果显示，Model组Col-Ⅰ和α-SMA的mRNA和蛋白相对表达量较Blank组显著增加，而PVSP-H组和PVSP-L组的相对表达量明显低于Model组，其中PVSP-H组较PVSP-L组降低更明显，由此推测PVSP的抗纤维化作用可能是通过降低Col-Ⅰ和α-SMA的表达，以减少ECM的生成并促进ECM的降解。本研究为将来PVSP应用于临床治疗肝纤维化又迈进了一步，其具体的分子机制还有待更深入的研究。

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