DC-GPC3联合CIK细胞的体外抗肝癌作用

韩秋青 ，姜锦 ，王玉亮

肝癌是全球第五大恶性肿瘤，具有很高的发病率和死亡率，全球每年约有62万患者被新诊断为肝癌［1］。由于中国人群中的慢性乙型肝炎病毒感染率较高，使得我国占到了世界所有新诊断肝癌病例的55%，成为全世界肝癌最高发的地区之一［2］。目前抗肿瘤生物免疫治疗模式在国内外备受关注，其对于清除微小的转移灶和隐匿瘤，预防肿瘤的复发和转移有较好的效果［3］。既往研究发现通过体外诱导的树突状细胞（dendritic cells，DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK）共孵育，可以有效提高CIK细胞的增殖能力及广谱抗肿瘤能力［4］，但缺乏特异识别肿瘤细胞的特性。研究显示，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，GPC3）可作为一个新的肝癌诊断、判断预后的生物标志物，以及肝癌生物免疫治疗新的靶点［5］。本研究拟将GPC3基因转染DC所得到的DC-GPC3与CIK共培养，观察其生物活性及体外抗肝癌作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肝癌细胞株HepG2和SK-Hep-1，白细胞介素（IL）-2依赖细胞株CTLL-2由卫生部危重病急救医学重点实验室于液氮冻存。人DC、DC-GPC3及CIK由卫生部危重病急救医学重点实验室于液氮冻存。RPMI 1640培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；重组粒单-集落刺激因子（GM-CSF）、IL-4、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-2、抗 CD3 单抗、异硫氰酸荧光素/藻红蛋白（FITC/PE）标记的鼠抗人CD单抗（美国BD公司）；IL-2、干扰素γ（IFN-γ）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（美国R&D公司）；乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测试剂盒（美国Promega公司）。FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；净化工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；多模式微孔板检测仪（美国PE公司）。

1.2 流式细胞术检测人DC、DC-GPC3以及CIK免疫表型 复苏液氮罐冻存人DC、DC-GPC3及CIK，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，调整细胞浓度至5×106细胞/mL，按各流式抗体试剂说明书操作，检测DC、DC-GPC3及 CIK 特异表面标志：DC（CD80、CD83、CD86）、CIK（CD3+CD8+、CD3+CD56+）。

1.3 DC和CIK细胞共培养 以DC-GPC3与CIK细胞按1∶5的比例混合，接种于细胞培养板，置于37℃、5%CO2孵箱中培养48 h，获得DCIK-GPC3作为实验组，调整细胞浓度为2×107/mL；以DC与CIK细胞按1∶5的比例混合，接种于细胞培养板，置于37℃、5%CO2孵箱中培养48 h，获得DCIK作为对照组，调整细胞浓度为2×107/mL。同时设单独培养的CIK细胞作为空白对照组，动态观察细胞形态。

1.4 流式细胞术检测人CIK、DCIK及DCIK-GPC3免疫表型 按各流式抗体试剂说明书操作，检测CIK、DCIK及DCIK-GPC3特异表面标志CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞。

1.5 MTT法检测细胞培养上清液中IL-2生物活性 取对数生长期IL-2依赖细胞株（CTLL-2），用完全培养液调整细胞浓度1×106/mL，加入96孔细胞培养板，每孔加入100µL，每孔分别加入CIK、DCIK及DCIK-GPC3细胞培养上清液50µL或稀释的IL-2标准品，并设3个平行孔，以1640培养液做阴性对照。细胞培养24 h后，加入20µL MTT（5 g/L），再培养4 h，用DMSO溶解孔中活细胞产生的甲瓒结晶，待结晶完全溶解后将96孔细胞培养板置于多模式微孔板检测仪，测定570 nm波长处各孔的光密度（OD）值，根据稀释IL-2标准品OD值绘制标准曲线，以标准品IL-2活性单位作横坐标，OD值作纵坐标，计算出各组细胞培养上清液IL-2生物活性。

1.6 细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ浓度检测 使用ELISA试剂盒测定CIK、DCIK及DCIK-GPC3细胞培养上清液IL-2、IFN-γ浓度，按照说明书操作。

1.7 细胞毒活性测定 分别以DCIK-GPC3、DCIK及CIK作为效应细胞，以对数生长期GPC3阳性的HepG2作为靶细胞，效应细胞与靶细胞按20∶1、50∶1比例混合接种于96孔细胞培养板，37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后，采用LDH释放法按操作说明书检测效应细胞的细胞毒活性。同时以对数生长期GPC3阴性的SK-Hep-1作为对照靶细胞，与DCIK-GPC3、DCIK按1∶20比例混合，采用LDH释放法检测细胞毒活性。

1.8 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验；2组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC及DC-GPC3免疫表型 DC表面CD80阳性细胞所占比例为82%，CD83阳性细胞所占比例为78%，CD86阳性细胞所占比例为86%；DC-GPC3表面CD80阳性细胞所占比例为83%，CD83阳性细胞所占比例为80%，CD86阳性细胞所占比例为87%，见图 1。

Fig.1 The phenotypic characteristics of DC and DC-GPC3图1DC及DC-GPC3免疫表型

2.2 各组效应细胞免疫表型 DCIK-GPC3表面CD3+CD8+和CD3+CD56+双阳性细胞百分比较DCIK及CIK明显增高，差异有统计学意义（F分别为39.983、65.371，P＜0.01），见图 2。

2.3 各组效应细胞分泌IL-2生物活性及浓度检测 各组效应细胞分泌IL-2生物活性及浓度水平差异有统计学意义（F分别为31.414、110.780，P＜0.01），CIK、DCIK、DCIK-GPC3 培养上清液分泌 IL-2生物活性及浓度依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图 3、4。

Fig.2 The phenotypic characteristics of effector cells图2 各组效应细胞免疫表型

Fig.3 The biological activity of secreted IL-2 of effector cells in supernatants图3 各组效应细胞培养上清液分泌IL-2生物活性

Fig.4 The concentration of secreted IL-2 of effector cells in supernatants图4 各组效应细胞培养上清液分泌IL-2浓度

2.4 各组效应细胞分泌IFN-γ浓度比较 各组效应细胞分泌IFN-γ浓度差异有统计学意义（F=30.636，P＜0.01）。CIK、DCIK、DCIK-GPC3 培养上清液分泌IFN-γ浓度依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图5。

Fig.5 The concentration of secreted IFN-γ of effector cells in supernatants图5 各组效应细胞培养上清液分泌IFN-γ浓度

2.5 各组效应细胞对肝癌细胞毒活性比较 在20∶1及50∶1效靶比，各组效应细胞对GPC3阳性的HepG2细胞毒活性差异有统计学意义（F分别为28.127、34.088，P＜0.01），CIK、DCIK、DCIK-GPC3对HepG2细胞的细胞毒活性依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图6。而在20∶1效靶比，DCIK-GPC3对 GPC3阴性的 SKHep-1细胞的细胞毒活性与DCIK比较差异无统计学意义（34.5%±3.1%vs.35.5%±3.7%，n=4，t=0.414，P＞0.05）。

Fig.6 The cytotoxic activity against HepG2 of effector cells图6 各组效应细胞对HepG2细胞的细胞毒活性

3 讨论

3.1 GPC3作为肝癌治疗靶点 近年国内外研究已证实，GPC3可成为一个新的肝癌诊断、判断预后的生物标志物，以及肝癌生物免疫治疗新的靶点［5］。如Bi等［6］将人源化抗GPC3抗体的单链可变片段与抗CD3抗体融合来制备靶向GPC3和CD3双特异性T细胞诱导剂，结果显示，其在体内外高效、特异性杀伤GPC3阳性表达的人类肝癌细胞。Sawada等［7］进行了 GPC3 肽疫苗作为肝细胞肝癌（HCC）患者的辅助治疗的Ⅱ期临床试验，结果显示，手术加疫苗接种的HCC患者术后复发率低于单纯接受手术的患者。GPC3肽疫苗可降低GPC3阳性肿瘤患者的1年复发率。因此，以GPC3为分子靶点的治疗是HCC治疗的有希望的候选方法。

3.2 DCIK-GPC3免疫表型 DCIK是DC与CIK共培养获得的一群异质效应细胞，成熟DC抑制了CD4+CD25+Treg细胞，后者可以明显抑制CIK中的CD3+CD8+和CD3+CD56+效应细胞发挥活性。加入DC可以有效消除这种免疫抑制效应，DCIK细胞的增殖以及杀伤活性明显增强。因此，将CIK和DC联合治疗恶性肿瘤，将有助于解除部分肿瘤患者T细胞的免疫无能，从而发挥协同抗肿瘤作用［8-9］。CIK表型以CD3+CD8+和CD3+CD56+双阳性细胞为主，本实验结果显示，DCIK-GPC3免疫表型CD3+CD8+和CD3+CD56+双阳性细胞百分比较DCIK及CIK细胞明显增高，这表明DC-GPC3和CIK细胞之间存在很重要的免疫调节关系，CIK细胞可以识别成熟的DC-GPC3，DC-GPC3又可以促进CIK效应细胞数量增多，这可以保证了DCIK-GPC3细胞具有更强的细胞毒活性。

3.3 DCIK-GPC3体外抗肝癌作用 本课题组前期研究证实，DCIK-GPC3效应细胞可明显抑制肝癌移植瘤生长［10］，在此基础上，本实验研究结果显示，随着效应细胞与靶细胞比例增加，各组对GPC3阳性的HepG2细胞的细胞毒性显著增加；在相同效靶比条件下，DCIK-GPC3、DCIK对HepG2细胞的细胞毒活性较CIK显著提高，其中以DCIK-GPC3的细胞毒活性最为显著。进一步在相同效靶比条件下，DCIK-GPC3对GPC3阴性的SK-Hep-1细胞的细胞毒活性与DCIK相比并无显著增高。这提示靶向GPC3的DCIK-GPC3对肝癌细胞的杀伤效应依赖GPC3分子的表达，具有较高的特异性，对高表达GPC3抗原肝癌细胞有更强的杀伤能力，从而弥补了DCIK非特异性杀伤的不足。本研究结果显示，与DCIK及CIK相比，DCIK-GPC3培养上清液中IL-2生物活性、浓度以及上清液中IFN-γ浓度水平均显著升高，提示DCIK-GPC3高效释放的生物活性物质IL-2及IFN-γ可正反馈促进DCIK-GPC3的高度活化，从而显著增强CIK效应细胞对肝癌细胞的特异性直接杀伤作用。

总之，CIK与DC-GPC3共培养可获得更强的特异性杀伤肝癌细胞活性，本研究为DCIK-GPC3治疗肝癌的临床转化提供了理论和实验依据。

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