不同程度颅脑创伤大鼠外周血内皮祖细胞动态变化及伤后认知能力的研究

王计伟，王毅，王东，周源，陈芳莲，崔维韻，刘丽，张建宁△

创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是神经外科的常见疾病，患者预后差，致残、致死率较高，给社会和患者家庭带来沉重的经济负担［1］。目前尚缺乏有效促进神经功能恢复的方法，而近年来大量研究发现内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）可维持血管稳态，并在颅脑创伤后归巢、黏附、迁移到损伤部位并增殖、分化为内皮细胞，修复血脑屏障，改善预后［2-3］。本研究通过对不同程度颅脑创伤大鼠循环血中的EPCs的数量进行测定，并研究其与认知功能改变的关系，旨在为后期研究TBI后EPCs参与血管神经修复的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和试剂 Model01-B型颅脑创伤仪（美国NEW SUN公司），TKR200C型小动物呼吸机（江西特力麻醉呼吸设备有限公司），台式牙钻（上海齿科医械厂），FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司），K1800型小动物血细胞检测仪（日本Sysmex公司），Morris水迷宫系统及分析软件（荷兰NOLDUS公司），低温高速离心机（美国Thermo Fisher公司），大鼠淋巴细胞分离液（美国Sigma公司），小鼠单克隆抗体PE-CD34和小鼠单克隆抗体CD133（美国Santa Cruz公司），FITC标记的山羊抗小鼠单克隆抗体IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），磷酸盐缓冲液（北京索莱宝科技有限公司），10%水合氯醛、增强型磷酸锌水门汀等试剂由天津市神经病学研究所提供。

1.2 实验动物和分组 SPF级雄性SD大鼠28只，体质量（275±10）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司动物中心提供，生产许可证号：SCXK（军）2014-0004。所有实验大鼠均置于室温、避免异常环境刺激干扰、昼夜交替（12 h/12 h）条件下饲养，饲养1周适应新环境后开始实验。采用随机数字表法分为4组：假手术组、轻度TBI组、中度TBI组、重度TBI组，每组7只。

1.3 大鼠TBI模型制备 参照第3版大鼠脑立体定位图谱［4］，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，注射剂量为300 mg/kg。待麻醉满意后，常规备皮，安尔碘消毒顶部正中切口部位，分离皮下暴露顶骨。选择前囟后4 mm，矢状缝右侧旁开3 mm处（大脑海马区域）用齿科磨钻钻孔开圆形骨窗，骨窗直径为4 mm，操作过程轻柔，保持完整的硬脑膜。用增强型磷酸锌水门汀将颅骨连接管固定在圆形骨窗边缘，待连接牢固后向管腔注入无菌生理盐水排空气泡，连接封闭液压颅脑创伤仪。待大鼠恢复角膜反射及夹尾反射后进行液压打击。打击后立即将大鼠置于电热恒温垫上进行抢救，小动物呼吸机面罩吸氧，必要时给予胸廓挤压，缝合头皮。待大鼠生命体征平稳后置回鼠笼继续饲养。假手术组仅开骨窗，不进行液压打击；轻、中、重度TBI组的液压打击力度分别为0.9、2.1 和 3.2 atm（1 atm=101.325 kPa）。

1.4 静脉血标本采集和处理 4组大鼠分别在创伤前（0 h）及创伤后 3、6、24、48、72、168、240、336 h 用直径 1 mm 的无菌硬质玻璃毛细采血管取大鼠内眦球后静脉丛血0.7 mL，置于EDTA抗凝管。其中0.6 mL参照文献［2］的方法，采用密度梯度离心法提取含有EPCs的单个核细胞，余0.1 mL进行白细胞（WBC）和血小板（PLT）计数。

1.5 EPCs的流式测定 将10µL小鼠单克隆抗体CD133与2µL FITC标记的山羊抗小鼠单克隆抗体混匀、震荡，避光孵育2 h，制备FITC标记的CD133。用0.5%BSA缓冲液将单个核细胞稀释混匀至100µL，加入PE-CD34和FITCCD133各10µL充分混匀后低速震荡，室温避光孵育10 min。加0.5%BSA缓冲液2 mL混匀后以1 500 r/min离心10 min以去除未结合的二抗工作液，用0.5%BSA缓冲液重悬单个核细胞后上流式细胞仪检测。首先在前向角散射/侧向角散射图中选择单个核细胞群体，排除细胞碎片和血小板的影响，然后检测CD133+和CD34+双阳性的细胞数量，即为EPCs数量。每个标本均计数200 000个单个核细胞，后续流式数据分析采用FlowJo软件。

1.6 水迷宫检测认知能力 参照Vorhees等［5］的报道，各组大鼠在TBI后第21～25天开始利用Morris水迷宫的方法检测其认知能力，在正式检测前1 d，将大鼠置于水槽内自由游泳2 min适应环境。定位巡航实验：将大鼠按随机顺序从4个不同象限投放入水，记录从象限出发点至寻找到并登上平台的时间，即逃避潜伏期。空间探索实验：定位巡航实验结束后，去除水下平台，将大鼠置于距离平台最远的象限自由游泳60 s，记录其在平台所在象限停留的次数，计算目标象限百分率（平台所在象限停留的次数/所有象限停留的次数×100%）。上述实验数据利用Morris水迷宫分析软件计算。

1.7 统计学方法 实验数据采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用重复测量资料的方差分析及单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠外周血EPCs数量变化 假手术组循环血中EPCs数量在伤后3 h出现相应升高，24 h后恢复至正常水平并保持稳定，而各颅脑创伤组大鼠在伤后3 h开始循环血中EPCs数量下降至最低值，并在伤后6 h升高，在伤后48 h开始恢复至正常水平，从TBI后24 h开始，各组间EPCs数量变化差异均无统计学意义，见表1。在伤后3 h，轻、中、重度颅脑创伤大鼠循环血中EPCs数量明显少于假手术组，在伤后6 h，轻、中度颅脑创伤组EPCs数量则明显高于假手术组，见表1。

2.2 外周血WBC、PLT水平变化 整个实验过程中各组WBC、PLT的变化并不一致。假手术组和轻度TBI组伤后3 h外周血WBC出现升高；中度TBI组整个实验过程中WBC变化差异无统计学意义；重度TBI组在TBI后72 h内WBC变化并不明显，伤后168 h开始出现下降。见表2。各组PLT则是在TBI后期出现了升高，见表3。

Tab.1 Changes of endothelial progenitor cells over time in different degrees of traumatic brain injury in rats图1 不同程度颅脑创伤大鼠的EPCs随时间的计数变化 （n=7，个/20万单个核细胞，±s）

Tab.1 Changes of endothelial progenitor cells over time in different degrees of traumatic brain injury in rats图1 不同程度颅脑创伤大鼠的EPCs随时间的计数变化 （n=7，个/20万单个核细胞，±s）

＊＊P＜0.01；F 时间=50.664＊＊，F 组间=0.533，F 交互=11.880＊＊；组间比较：A与假手术组比较，B与轻度 TBI组比较，P＜0.05；组内不同时间比较：a与0 h比较，b与TBI后3 h比较，c与TBI后6 h比较，P＜0.05

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Tab.2 Changes of white blood cells over time in different degrees of traumatic brain injury in rats表2 不同程度颅脑创伤大鼠白细胞计数随时间的计数变化 （n=7，×109/L，±s）

Tab.2 Changes of white blood cells over time in different degrees of traumatic brain injury in rats表2 不同程度颅脑创伤大鼠白细胞计数随时间的计数变化 （n=7，×109/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F 时间=14.040，F 组间=3.977，F 交互=2.528，均 P＜0.05；组间比较：A与假手术组比较，B与轻度 TBI组比较，P＜0.05；组内不同时间比较：a与0 h比较，b与TBI后3 h比较，c与TBI后6 h比较，P＜0.05

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Tab.3 Changes of platelets over time in different degrees of traumatic brain injury in rats表3 不同程度颅脑创伤大鼠血小板计数随时间的计数变化 （n=7，×109/L，±s）

Tab.3 Changes of platelets over time in different degrees of traumatic brain injury in rats表3 不同程度颅脑创伤大鼠血小板计数随时间的计数变化 （n=7，×109/L，±s）

＊＊P＜0.01；F 时间=23.368＊＊，F 组间=1.244，F 交互=2.635＊＊；组间比较：A与假手术组比较，B与轻度 TBI组比较，P＜0.05；组内不同时间比较：a与0 h比较，b与TBI后3 h比较，c与TBI后6 h比较，P＜0.05

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2.3 大鼠认知能力变化 各组大鼠逃避潜伏期随着创伤时间的延长而缩短，见图1A；同期各TBI组逃避潜伏期均较假手术组延长。空间探索实验结果显示，假手术组目标象限百分率为50.2%±12.8%，而轻、中、重TBI组的目标象限百分率分别为46.1%±10.2%、33.4%±9.1%、25.1±6.9%，中、重度 TBI组大鼠停留在目标象限百分率低于假手术组和轻度TBI组，见图1B。

Fig.1 Cognitive abilities of different degrees of traumatic brain injury in rats图1 不同程度颅脑创伤大鼠的认知能力检测

3 讨论

TBI致残致死率高、预后差，是45岁以下青壮年死亡的主要原因，伤后常伴意识水平及内容减退等高级神经功能障碍［1］。由于原发性颅脑创伤干预困难，故目前的治疗措施主要关注在TBI后血脑屏障破坏、血管神经损伤、异常炎症反应等继发性颅脑损伤的防治。Asahara等［6］在1997年首次从人循环血中成功分离到EPCs，并确认其为参与血管生成的未分化细胞，可增殖分化为成熟血管内皮细胞，虽然数量少，但具有较大的组织修复意义。越来越多的研究发现，EPCs在糖尿病［7］、心血管疾病［8］、自身免疫性疾病［9］、脑卒中［10］等多种疾病中具有潜在的治疗价值。而本课题组的前期研究也发现，通过提高颅脑创伤大鼠循环血中的EPCs数量，可以促进血管新生，修复血脑屏障，改善预后［3，11］。因此 EPCs的研究有望改善TBI后的神经血管修复，为TBI的治疗提供了新的思路，有必要对EPCs进行更加深入的基础研究。

本研究发现，颅脑创伤后，循环血中EPCs数量在伤后3 h开始下降至最低值，并在伤后6 h升高，在伤后48 h始恢复至正常水平，此先低后高的变化趋势与之前的研究结果一致［12］。结合前期研究成果，笔者推测EPCs的动态变化的原因可能是由于循环血EPCs向创伤灶归巢消耗导致其数量降低，后动员骨髓EPCs入血使其升高；脑创伤急性期的应激状态导致内分泌轴紊乱，抑制早期的EPCs动员。由于血小板与血管新生关系密切，且EPCs取自单个核细胞，故笔者也研究了EPCs与上述两者之间的关系，结果发现整个实验过程中EPCs的变化与WBC和PLT并不一致。Guo等［13］最新的研究证实，静脉输注体外培养的EPCs可选择性地归巢到颅脑损伤部位，而不归巢至正常脑组织，通过修复血管功能继而起到神经再生、保护神经功能的作用。本实验中也发现大鼠颅脑创伤后EPCs的数量变化与其认知能力密切相关：轻度TBI组大鼠EPCs数量在伤后6 h与假手术组相比明显升高，而此时重度TBI组EPCs数量仍低于假手术组。Morris水迷宫实验结果发现轻度TBI组逃避潜伏期和目标象限百分率明显优于重度TBI组，提示高水平的EPCs有助于提高TBI后认知能力的恢复。

综上，TBI大鼠循环血EPCs的水平与疾病严重程度密切相关，高水平的EPCs有助于改善预后，可作为判断预后的标志物。本研究对以后深入开展的TBI后EPCs参与的血管神经修复机制研究和调控EPCs数量治疗TBI的研究奠定了基础。

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