口蹄疫病毒3ABC单抗阻断ELISA抗体检测方法应用

，

(光明牧业有限公司 200436)

根据新型口蹄疫疫苗生产工艺，用灭活疫苗免疫的动物不会产生病毒非结构蛋白3ABC抗体。因此，采用口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC单抗阻断ELISA试验，可以区分免疫抗体与自然感染抗体。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 随机抽取基地牧场3-4月龄经过口蹄疫灭活三价疫苗免疫健康犊牛30-40头。

1.1.2试验试剂盒 采用中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫病毒3ABC单抗阻断ELISA抗体检测试剂盒，批次：20160912129。

1.2实验步骤

1.2.1试剂盒准备 试剂盒放置室温恒温1-2 h。

1.2.2试剂准备 PBST洗涤液按试剂盒说明书进行配制1∶25倍稀释。

1.2.3加入血样 在捕获3ABC抗原酶标板每孔中加入80 μL血清稀释液，然后依次加入20 μL阴、弱阳性、阳性对照血清各平行2孔、血清样品各一孔，混匀，封上封口膜，盖上板盖，室温(18-25℃)反应20 h。

1.2.4洗板 用PBST稀释液连续洗涤5次，在吸水纸上拍干。

1.2.5加酶标单克隆抗体 用血清稀释液1∶100比例稀释酶标单克隆抗体，每孔加入100 μL，封口膜封口，室温(18-25℃)孵育60 min。

1.2.6洗酶标板 用PBST稀释液连续洗酶标板5次，在吸水纸上甩干。

1.2.7加底物溶液 每孔加入100 μL底物溶液，封口膜封口，室温(18-25℃)避光作用12 min，在酶标仪上读取OD630值，并控制在0.5-0.6之间。

1.2.8加终止液 每孔加入100 μL终止液，轻轻震荡混匀，在酶标仪上读取D450 nm吸光值。

1.2.9结果计算 1)计算阴性、弱阳性、阳性对照血清平均OD450值。2) 计算阻断率公式PI=(1-测试样品OD450值/阴性对照平均OD450值)×100%。

1.2.10实验结果判定 1)实验成立条件：阴性对照平均OD450值>1.0；弱阳性对照血清阻断率>50%，阳性对照血清阻断率>70%。2)结果判定标准：血清样品PI值≥50%，判为非结构蛋白抗体阳性；血清样品PI值<50%，判为阴性。

2 实验结果

口蹄疫病毒3ABC抗体检出率见表1。

表1 口蹄疫病毒3ABC抗体检出率

3 分析

本实验采用基于两种单克隆抗体(Mab)的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体阻断ELISA方法监测，自2016年11月起至2017年5月结束，样品2063份，检出率平均值为0.82%。根据免疫登记信息，3ABC阳性抗体犊牛都已经口蹄疫三价苗免疫，结合后期临床诊断，阳性犊牛无感染口蹄疫病毒症状产生，体况健康，判为假阳性。有文献资料显示如使用了抗原纯化度不高的口蹄疫三价苗，会出现3ABC假性抗体，建议牧场在疫苗使用上尽量选择抗原纯化度较高的口蹄疫疫苗，避免假阳性的产生。