离子色谱法同时测定葡萄酒中26种有机酸和阴离子

宋卫得，李兆杰，刘 冰，姜维珍，叶佳宇，李林杰，李 健

（1.日照出入境检验检疫局，山东日照276826； 2.威海出入境检验检疫局，山东威海264200）

有机酸是酒中重要的风味物质，葡萄酒中主要有机酸有乳酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、甲酸、丁酸等[1]，有机酸的种类和含量影响着葡萄酒的色泽、口感、生物稳定性；葡萄酒中有毒有害阴离子超标时，就会危害人体健康；有机酸含量测定还可监控生产、识别质量、辨别掺假等[2]。因此，建立葡萄酒中多种有机酸和阴离子同时检测的方法，对于葡萄酒酿制过程质量控制和产品质量监控具有重要的实用价值。

离子色谱法具有高效、快速、灵敏、准确等优点[3-8]，是同时测定有机酸和阴离子的理想方法。潘丙珍等[9]采用离子色谱法测定了酒中16种有机酸，但是存在基线不平稳、检测组分较少等不足；吴飞燕等[10]采用离子色谱法建立了酒中17种有机酸同时检测的方法，灵敏度高，但仅分析了有机酸类物质，需52 min后才能全部出峰。目前离子色谱法测定葡萄酒中多种有机酸和阴离子的方法研究较少，且存在分析组分少、影响因素考察不全、检测时间较长等不足。本研究采用多级梯度淋洗离子色谱法，分析实验影响因素，优化色谱分离条件，建立了同时测定葡萄酒中26种有机酸和阴离子的方法，26种组分在32 min内即可全部出峰，实现了快速分析、绿色分析、多组分同时分析的目标。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂

酒样：国产、进口的红白葡萄酒，市售。

仪器：离子色谱仪（Dionex ICS2100），配备电导检测器和自动进样器（AS-DV）；自动再生抑制器（ASRS 300）；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

试剂：超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）；8种阴离子标准溶液（济南众标科技有限公司），质量浓度为1000 mg/L；18种有机酸均为优级纯以上级别试剂，使用时配成所需的质量浓度。

1.2 离子色谱条件

阴离子分离柱：Dionex IonPacTMAS11-HC；保护柱：Dionex IonPacTMAG11-HC；抑制器再生模式：外加水电导抑制，电导检测器检测；流动相：KOH梯度淋洗液；流速：1.00 mL/min；柱温：30℃；进样量：50 μL。

1.3 前处理步骤

采用浓度为2.0 mol/L的KOH溶液，调节pH值至5.3～6.0，取10 mL样品放入50 mL离心管中，移取上清液样品1.0 mL，用超纯水定容至100 mL容量瓶中，摇匀、静置10 min，取10.0 mL溶液，过0.22 μm水相滤膜，弃去前面3 mL，收集后面清液，待上机检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 色谱柱的选择

在相同实验条件下，先后进行了AS11-HC、AS11、AS19共3种色谱柱的分析对比实验。实验结果表明，使用AS11-HC色谱柱时多数组分峰型较尖锐、灵敏度较好。这是因为AS11-HC是一种高容量、强亲水性色谱柱，尤其适用于食品中多种有机酸和阴离子同时测定。因此，选择AS11-HC色谱柱进行实验分析。

2.1.2 流速的选择

分别进行了0.50 mL/min、0.75 mL/min、1.00 mL/min、1.25 mL/min、1.50 mL/min 5个流速条件下的实验对比。在0.50 mL/min和0.75 mL/min流速时，因流速低，压力小，峰宽较大，总出峰时间较长，灵敏度不高。1.25 mL/min和1.50 mL/min流速时系统压力不断升高，压力过大易损害色谱柱的固定相，从而极大影响色谱柱使用寿命。在1.00 mL/min时，压力大小适中，灵敏度高，总出峰时间缩至32 min。综合考虑各种影响因素，实验流速选择1.00 mL/min。

2.1.3 pH值的选择

首先进行了0.01～10.0 mg/L浓度混合标准溶液的pH值测定实验，实验发现，当标准混合溶液中组分浓度由0.01增至10.0 mg/L时，溶液中H+浓度增大，溶液酸性逐渐增大，pH值由5.47降为3.52。

本实验所测组分中，存在一些不稳定的弱酸和有机酸，如ClO2-和NO2-离子，受到溶液pH值影响较大，pH值小于4.0时，ClO2-和NO2-离子检测浓度低于理论浓度的80%，这正是与溶液中高浓度的H+发生反应而产生的损失。本实验使用KOH溶液来调节一系列不同pH值的去离子水溶液为溶剂，而后配制不同pH值的同一理论浓度混合标准溶液，进而测定26种组分在不同pH值时测定含量的变化。结果表明，弱酸和不稳定有机酸在强酸性条件下受影响较大，而在pH5.5～7.0时，多数组分检测含量稳定、变化小。这是因为多数有机酸的解离常数pKa值在4.2～6.9，当pH值与pKa值相等时，溶液中的离子型分子和中性分子的浓度相同，组分处于相对稳定的状态，便于定量分析。

考虑到葡萄酒的pH值一般在2.7～4.0范围，而pH值大小又直接影响着某些弱酸和不稳定有机酸的电离程度，实验发现，稀释100倍后酒类样品的pH值处于4.5～6.0，考虑到中性或弱酸性环境下，标准溶液和测定样品中多数组分处于含量稳定状态，因此，本次实验选取标准溶液配制至pH值为5.3～6.0之间。

2.1.4 梯度淋洗条件的选择

本试验一次性测定多种组分，而个别组分结构性能类似、分子量相近，普通淋洗浓度梯度条件，难以保证26种组分的有效分离。根据实验结果和各种组分的色谱柱保留特性，将26种组分分为3类：弱保留组分（1～13）、中等保留组分（14～21）、强保留组分（22～26）。首先，0～6 min为初始淋洗浓度时间段，分别进行了0.80 mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L初始浓度时的实验对比，发现在0.80 mmol/L初始浓度下，各组分出峰时间拖后，总出峰时间延长，且前3种弱保留组分的分离度不理想；1.25 mmol/L初始浓度时，前10种弱保留组分分离效果不好；初始浓度1.00 mmol/L时，多数组分色谱峰的分离状况较理想。因此，选择1.00 mmol/L为初始淋洗浓度。

6～22 min时，出峰组分有21种，在实验时最初选择使用了2次淋洗浓度变化，但此时难以确保21种组分的有效分离。前后进行了30多次实验分析对比，最终选择了使用3次淋洗浓度和淋洗斜率的变化，首先，在6～13 min时，淋洗浓度由1.0 mmol/L增至14.0 mmol/L，淋洗斜率为1.857 mmol/L·min；在13～17 min时，淋洗浓度由14.0 mmol/L增至14.5 mmol/L，此时基本是一个等度淋洗浓度，斜率只有0.125 mmol/L·min；在17～22 min时，选取淋洗斜率为0.700mmol/L·min，淋洗浓度由14.5mmol/L增至18.0 mmol/L。在此梯度淋洗条件下，21种组分灵敏度较高，分离效果理想。

在22～33 min时，进行了最高淋洗浓度分别为50 mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L条件下对比分析实验。实验结果证实，最高淋洗浓度为50 mmol/L时，淋洗浓度较低，5种强保留组分出峰时间拖后，且灵敏度不高；最高淋洗浓度为70 mmol/L时，5种组分出峰速度快，灵敏度较高，但分离度不高，且组分峰有重叠情况；最高淋洗浓度为60 mmol/L时，5种强保留组分灵敏度和分离度较好，因此，选择60 mmol/L为最高淋洗浓度。

总之，初始浓度的选择、淋洗斜率大小、最高淋洗浓度的选择及时间段的划分都是影响多组分分离测定效果的重要因素。通过科学系统的研究，综合分析各种实验影响因素，实现了32 min内快速准确测定葡萄酒中26种有机酸和阴离子的目标。淋洗条件见表1，离子色谱图见图1。

表1 离子色谱多级梯度淋洗条件

图1 26种组分混合标准溶液的离子色谱图

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围与检出限（表2）

进行了26种有机酸和阴离子的混合标准溶液测定实验，进行校准曲线拟合。通过色谱峰信噪比来计算待测组分的检出限（S/N=3），在0.01～1.00 mg/L浓度范围内，进行了7个不同浓度水平（0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L）标准工作液的检测和线性拟合。实验证实，26种组分线性相关系数均大于0.99，除了F-外，其他7种无机阴离子相关系数均大于0.995，线性较好；个别有机酸由于分离度不够或自身不稳定，线性相关性不理想；总体来说，26种组分线性均已达到食品理化定量技术要求。25种组分检出限在0.00009～0.0783 mg/L之间，仅有苯甲酸检出限为0.201 mg/L，本次实验的检出限较前期研究时有所增大，主要是实验时色谱柱使用时间较长，基线噪音有所增大的原因。

表2 测定组分的线性范围、线性方程、相关系数及检出限(S/N=3)

2.2.2 回收率与精密度

选取3种葡萄酒样品，依次向3种样品中添加浓度级别水平分别为0.10 mg/L、0.20 mg/L、1.00 mg/L的混合标准溶液，每个浓度水平进行6次平行测定实验，来验证方法的回收率和精密度。方法回收率和RSD数据见表3。

由表3可看出，在0.10 mg/L添加浓度水平下，回收率在75.97%～109.80%之间，RSD在0.22%～8.38%范围内；在0.20 mg/L添加浓度水平下，回收率在78.24%～107.25%之间，RSD在0.71%～8.06%范围内；在1.00 mg/L添加浓度水平下，回收率在80.59%～105.84%，RSD在0.78%～5.66%范围。实验数据表明，随着添加浓度的增大，回收率和RSD数据范围逐渐变小，准确度和精密度渐趋稳定。3个浓度水平下，苯甲酸的回收率在78.24%～81.30%之间，其中两个浓度下RSD数据大于8.0%，主要因为苯甲酸是离子半径较大、疏水性较强的有机酸，且自身不稳定，因此色谱峰型不对称。顺乌头酸在0.10 mg/L和0.20 mg/L添加浓度水平下，回收率分别为75.97%和83.58%，这是因为顺乌头酸不够稳定，在一定条件下，有小部分转化成反乌头酸，表3中反乌头酸回收率偏大也证实了这一点，但小部分的转化并不影响定性定量分析，回收率和精密度依然满足食品理化检验技术要求。从总体上来看，3个浓度水平、6次平行检测回收率数据结果比较理想，说明葡萄酒中26种组分同时检测的方法精密度高、稳定性好。

2.2.3 准确度

选取一种葡萄酒，添加0.50 mg/L浓度水平标准溶液，进行3 d 9次平行测定实验。理论真值以基质浓度和添加浓度相加来计，计算出9次测定值和理论真值的相对偏差。实验数据表明，葡萄酒（0.50 mg/L）中26组分的9次平行实验结果与理论真值的相对偏差在-15.09%～9.57%范围内，满足食品理化准确度技术要求，充分验证了检测方法的准确性。

表3 测定组分的回收率及精密度(RSD)(n=6)

2.3 实际样品测定

选取5种代表性葡萄酒样品（国产红葡萄酒2种、进口红葡萄酒2种、进口白葡萄酒1种），根据所选前处理方法和离子色谱条件，检测了葡萄酒实际样品中有机酸和阴离子含量。

由图2可看出，葡萄酒中主要的有机酸有乳酸、乙酸、戊酸、戊二酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、顺乌头酸、富马酸、甲酸、丁酸等，无机阴离子有Cl-、NO3-、PO43-。仅有一个红葡萄酒样品中检出微量 NO2-，有毒有害的 ClO2-、BrO3-、CrO42-阴离子均未检出，说明这些葡萄酒酿造所用原料质量和水质较好。从色谱图中看出，除乳酸和乙酸组分浓度较高，分离度不理想，其他各种组分色谱峰尖锐，分离度较好，说明方法的灵敏度好、稳定性高。

从红葡萄酒和白葡萄酒图谱对比来看，红葡萄酒中乳酸、戊酸、草酸的含量较高，而白葡萄酒中的琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、Cl-、NO3-、PO43-比红葡萄酒中高，这主要因为白葡萄酒是用白葡萄或者红葡萄去皮和去核后压榨、发酵而成，而红葡萄酒却是用红葡萄连带葡萄皮和果核酿制而成，原料和酿制方法的不同是白葡萄酒和红葡萄酒的有机酸和阴离子含量不同的主要原因。

3 结论

通过对色谱柱、流速、溶液pH值、初始梯度浓度等多种实验影响因素的分析，探索出适合葡萄酒中26种组分分离的梯度淋洗条件，建立了多级梯度淋洗-离子色谱法同时测定葡萄酒中26种有机酸和阴离子的方法。实验结果证实，流速为1.00 mL/min，柱温为30℃，pH值在5.3～6.0之间时，26种组分的分离效果理想。对比发现，本方法主要优点有：（1）一次性同时检测26种组分，实现了有机酸、阴离子、防腐剂等多种类组分同时检测；（2）多因素多角度考察分析实验影响因素，有效提高了多组分检测方法的稳定性和准确性；（3）操作快速便捷、灵敏度高、适用性强，经简单前处理后上机测定，32 min内26种组分全部出峰。由此可见，该方法快速、简便、灵敏、准确，完全适于葡萄酒中26种有机酸和阴离子的分析测定。

图2 5种葡萄酒样品的离子色谱图

参考文献：

[1]ZERAVIK J,FOHLEROVA Z,MILOVANOVIC M,et al.Various instrumental approaches for determination of organic acids in wines[J].Food chemistry,2016,194(1)：432-440.

[2]向进乐,杜琳,郭香凤,等.离子抑制反相高效液相色谱法测定菠萝果酒中10种有机酸[J].中国食品学报,2014,14(6)：229.

[3]GENG X M,ZHANG S F,WANG Q,et al.Determination of organic acids in the presence of inorganic anions by ion chromatography with suppressed conductivity detection[J].Journal of chromatography A,2008,1192(1)：187-190.

[4]邵宏宏,周秀锦,周向阳,等.抑制型离子色谱法测定海产品中的有机酸类鲜味物质[J].中国调味品,2014,39(3)：94-97.

[5]LUO X M,CHEN L,ZHAO Y Q.Simultaneous determination of three chloroacetic acids,three herbicides,and 12 anions in water by ionchromatography[J].Journal of separation science,2015,38(17)：3096-3102.

[6]GUO B,ZHAO Y,LIU J Y.Simultaneous determination of seven carbohydrates in tobacco by ultrasonic extraction-ion chromatography[J].Asian journal of chemistry,2014,26(16)：5149-5155.

[7]施超欧,姚宝龙,胡咪,等.离子转换色谱-紫外检测法测定啤酒中的无机阴离子和有机酸[J].色谱,2016,34(10)：951-955.

[8]DOLGONOSOV A M,KOLOTILINA N K.Ion-exchange sample preparation for the determination of anions in highly alkaline solutions by ion chromatography[J].Journal of analytical chemistry,2015,70(11)：1322-1324.

[9]潘丙珍,刘青,庞世琦,等.离子色谱法测定酒中的有机酸和无机阴离子[J].现代食品科技,2013,29(4)：876-877.

[10]吴飞燕,贾之慎,朱岩.离子色谱电导检测法测定酒中的有机酸和无机阴离子[J].浙江大学学报,2006,33(3)：312-313.