YSY16酵母在降低陶融型原酒高级醇含量中的应用研究

2018-04-26李建民韩素娜杨方玉乔艳明

酿酒科技 2018年4期

李建民，韩素娜，晏丽，杨方玉，乔艳明

（1.河南仰韶酒业有限公司，河南渑池472400； 2.汉中职业技术学院药学与医学技术系，陕西汉中723000；3.江南大学生物工程学院，江苏无锡214000）

高级醇是一元醇中分子式含碳原子数大于2的一类醇的统称，是白酒中重要的呈香物质，它能够增加白酒的协调感和饱满感[1]。但在高度原浆酒降度过程中，高级醇是导致白酒出现白色浑浊物的主要原因，另外高级醇因碳链长分子量大导致其在人体内代谢缓慢，会促使人的大脑充血和神经中毒，也就是人们俗称的“上头”[2-3]。目前，国内许多酒厂都在研究如何降低原浆酒中高级醇的含量，有关降低高级醇的研究一般通过优化生产工艺、添加酶制剂和酵母等3种途径。李长文等[4]通过正交试验优化蛋白酶、糖化酶和干酵母的添加量，高级醇在固态白酒中生成量降低48%；宗绪岩等[5]通过控制添加生物制剂的比例，使浓香型白酒高级醇生成量降低21.06%；孙金旭[6]通过优化糖化酶的添加量，使酱香型白酒的高级醇总含量降低了48.28%，而目前国内有关陶融型白酒高级醇的研究尚无报道。

仰韶陶融型白酒作为我国第十三种香型白酒[7]，以其“醹、雅、融”的口感而被广大消费者喜爱，而有关陶融型原浆酒中的高级醇研究还是空白。原浆酒在生产过程中高级醇主要是通过2条途径产生，一是在酵母繁殖过程中分解氨基酸代谢形成的Ehrlich途径，一是以葡萄糖为基质的合成路线即Harrsi途径[8-9]。本研究基于酵母Ehrlich代谢途径，以河南仰韶酒厂自主分离的YSY16酵母菌株为试材，制备纯种酵母麸曲，考察酒醅中麸曲的不同添加量对原浆酒中高级醇含量的影响，以期得到一种陶融型原浆酒中高级醇含量的有效调控方法，为仰韶陶融型白酒的生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料

菌株：YSY16酵母菌，仰韶酒业酿酒微生物实验室（该菌株的分离、鉴定在参考文献[7]中已发表，被鉴定为酿酒酵母）。

酒醅（河南仰韶酒业有限公司）：用取样袋，从仰韶酒厂陶融车间获取蒸馏过酒的酒醅。

1.1.2 主要试剂

试剂：乙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇（GR，上海生物工程有限公司）。

60%乙醇溶液配制：精确量取色谱标准品乙醇60 mL，用超纯去离子水定容至100 mL容量瓶。

标准溶液配制：分别精确量取色谱标准品正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇各0.20 mL，用60%vol乙醇溶液定容至1000 mL容量瓶。

内标溶液配制：精确称取标准品乙酸正丁酯2.0 mL，用60%vol乙醇溶液定容至100 mL容量瓶。

1.1.3 仪器设备

Thermo Scientific Trace1310-ISQ气相色谱-质谱联用仪，美国赛默飞世尔科技公司；MJX-250生化培养箱，杭州汇尔仪器设备有限公司；eppendorf移液器，Eppendorf公司；12 L304不锈钢蒸馏器，烟台帝伯仕自酿机有限公司；等。

1.2 试验方法

1.2.1 气相色谱-质谱分析条件[10-11]和样品检测

色谱柱：毛细管柱DB-FFAP（60.0 m×0.25 mm×0.25 mm）；程序升温：起始温度50℃，保持8 min，然后以5℃/min升温到230℃,保持15 min；载气为N2，流速0.6 mL/min，进样口温度220℃，检测器温度230 ℃，分流比 33∶1，进样 1 μL。质谱条件：EI电离源，电子能量70 eV，质量范围20～550 u，离子源温度230℃，接口温度230℃。

样品检测：吸取200 μL内标乙酸正丁酯溶液，置于10 mL的容量瓶中，用每一酵母添加量梯度的酒样定容，充分混匀，取混合酒样/内标溶液1 μL于色谱进样瓶中，气质联用仪测定。

1.2.2 标准曲线的绘制[12]

用移液器分别吸取正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇的标准溶液0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置于10 mL容量瓶中，每一容量瓶中均加入内标乙酸正丁酯溶液200 μL，充分混匀，然后用60%vol乙醇溶液定容，取各浓度下混合标样/内标溶液1 μL于色谱进样瓶中，气质联用仪测定，各标样溶液浓度结果见表1。

1.2.3 样品实验发酵

纯种YSY16菌株麸曲制备：将培养好的液态纯种YSY16菌株，接种于卡氏罐，30℃恒温培养5 d，卡氏罐中培养好的YSY16菌株全部接种于蒸汽灭菌的麸曲中培养。采用梯度稀释法，对培养好的纯种YSY16菌株麸曲检测菌株数量，菌株数量达到108为合格标准麸曲。

表1 标准溶液浓度 (g/L)

实验样品发酵：取车间配制好的酒醅，每份称取2000 g，并在每份中添加检测合格的纯种YSY16菌株麸曲，按照0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的比例，每一梯度平行3次，搅拌均匀后分别装入2 L发酵瓶中，密封发酵瓶，置于生化培养箱中。培养箱设置条件：起始温度18℃，以2℃/d的条件保持升温9 d，升温到顶温36℃，顶温保持7 d，再以1℃/d的条件保持降温12 d，使培养箱温度达到24℃，发酵周期为28 d，确保酒醅在实验室培养箱中发酵条件和周期与生产车间保持一致。

蒸馏取酒：将发酵好的酒醅取出来，置于不锈钢蒸馏器中，在蒸馏取酒过程中注意根据蒸汽情况添加酒醅，注意冷却水的温度。

2 结果与分析

2.1 正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇的标准曲线

将1 μL标准品/内标混合物通过气相质谱联用仪检测，整理所获得数据，以标准品浓度比内标乙酸正丁酯的浓度为X（C/Ci）轴，以标准品峰面积比内标品峰面积为Y（A/Ai）轴，建立标准曲线，结果见图1。

图1中A为正丙醇标准曲线图，其标准方程为y=0.8652x-0.0029，R2值0.9962；图1中B为正丁醇标准曲线图，其标准方程为y=1.2826x-0.015，R2值0.9989；图1中C为异丁醇标准曲线图，其标准方程为y=1.2422x+0.0069，R2值0.9978；图1中D为异戊醇标准曲线图，其标准方程为y=1.1665x+0.0697，R2值0.9979。4条标准曲线的相关系数均在两个9以上，线性关系接近1，符合标准曲线要求，可以用于实验数据分析。

2.2 实验蒸馏酒中4种高级醇的气相质谱检测

将实验室模拟发酵瓶中的酒样，通过气质联用仪测定，结果见图2。

由图2可知，实验室模拟发酵蒸馏获得酒样可以检测到这原酒中常检查的1种样品，其正丙醇的保留时间为2.633 min，异丁醇的保留时间为3.991 min，正丁醇的保留时间为5.276 min，异戊醇的保留时间为8.630 min。

2.3 不同酵母添加量对4种高级醇产量的影响

2.3.1 不同酵母添加量对正丙醇产量的影响

将酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培养箱中发酵，发酵结束后，获得陶融型实验酒样，经气相质谱联用仪检测，酒样中正丙醇产量结果见图3。

图1 高级醇标准曲线

图2 气相质谱检测结果

图3 不同酵母添加量对正丙醇产量变化的影响

由图3可知，正丙醇产量在前期随着酵母添加量的增加明显减少，可能是减少发酵前期酒醅中酵母菌的增殖倍数，增加了对氮源的消耗量，对Ehrlich途径机制起到了反馈性抑制。当酵母添加量达到1.50%的比例时，正丙醇产量最低，为0.394 g/L，正丙醇的减少量达到了76.8%。因此，酵母添加量为1.50%，陶融型酒中的正丙醇含量最低。

2.3.2 不同酵母添加量对正丁醇产量的影响

将酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培养箱中发酵至结束，获得陶融型实验酒样，经气相质谱联用仪检测，酒样中正丁醇产量结果见图4。

由图4可知，当酵母添加量达到2.0%时，正丁醇产量最低。当酵母添加量在0.5%～2.0%时，正丁醇产量明显减少，当酵母添加量在2.50%时，正丁醇产量开始增加。因此，酵母添加量为2.0%，陶融型酒中的正丁醇产量最低。孙金旭等[13]的研究发现，添加酵母菌后，正丁醇产量就会明显下降，下降比例达到165%，而本研究发现，在酵母添加量为0%～2%时，正丁醇产量缓慢下降，酵母菌添加量超出2%时，正丁醇产量反而上升。

图4 不同酵母添加量对正丁醇产量变化的影响

2.3.3 不同酵母添加量对异丁醇产量的影响

将酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培养箱中发酵至结束，获得陶融型实验酒样，经气相质谱联用仪检测，酒样中异丁醇产量结果见图5。

图5 不同酵母添加量对异丁醇产量变化的影响

由图5得知，在酵母添加量为1.0%时，异丁醇产量最低，比没有添加酵母时的异丁醇产量降低了72.2%。当酵母添加量大于1.0%以后，异丁醇产量开始显著增加。因此，酵母添加量为1.0%，仰韶陶融型酒中的异丁醇产量最低。相比朱静等[14]对原酒中异丁醇的降解的研究，本研究的优点在于添加酵母菌的方法更加适用于生产，并且还能增加酒醅中酵母菌的含量，可增加酒醅的活力，更加有利于提高原酒产量。

2.3.4 不同酵母添加量对异戊醇产量的影响

将酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培养箱中发酵至结束，获得陶融型实验酒样，经气相质谱联用仪检测，酒样中异戊醇产量结果见图6。

式（1）中，被解释变量inboundit表示i地区t时期入境旅游人次的对数；policyit是政策虚拟变量，如果样本属于处理组（实施过境免签政策地区）取值为1，相反，如果样本属于对照组（未实施过境免签政策地区）取值为0；timeit为时间虚拟变量，政策实施前取值为0，政策实施后取值为1；Xit为控制变量；αi和γt分别表示个体效应和时间效应；Vit为随机干扰项。PSM-DID方法重点关注估计系数β3，衡量的是过境免签政策的净效应，即过境免签政策对入境旅游的促进作用。

图6 不同酵母添加量对异戊醇产量变化的影响

由图6可知，当酵母添加量为1.50%时，异戊醇产量为最少，比未添加酵母的异戊醇产量降低0.469 g/L。孙金旭[15]对酱香型白酒中异戊醇的产量研究中得到酵母添加量为2.0%时，异戊醇产量最低，这和本次实验结果不同，因为陶融型原浆酒在生产工艺和酒曲的使用方面与酱香型都不同。因此，酵母添加量为1.50%，仰韶陶融型酒中的异戊醇产量最低。

2.4 生产检验

通过实验室模拟发酵结果为依据，当酵母添加量为1.50%时，总高级醇产量最低为1.133 g/L，所以在生产车间额外添加1.50%培养成熟的纯种YSY16菌株麸曲。通过窖池发酵蒸馏取酒，经GC-MS检测陶融型原浆酒中4种高级醇的含量，结果见图7。

图7 生产车间高级醇产量

由图7可知，在仰韶陶融型生产车间添加1.50%的纯种麸曲酵母，正丙醇产量比没有添加纯种麸曲酵母的降低了49.1%，正丁醇产量比没有添加纯种麸曲酵母的降低了28.8%，异丁醇产量比没有添加纯种麸曲酵母的降低了11.4%，异戊醇产量比没有添加纯种麸曲酵母的降低了16.9%。在未添加酵母时，生产车间酿造出的酒样中4种高级醇含量均比实验室含量低，这可能与生产车间窖池中窖泥的存在有关。在酵母添加量为1.50%时，生产车间酿造出的酒样中4种高级醇除了正丙醇含量比实验室含量低，其余3种高级醇含量均高于实验室酒样含量，因为车间酒醅的水分、大曲用量、谷壳用量、酒醅pH值、酒醅与粮食配比等对高级醇的产量都有很大影响，而整个操作过程全部是凭借生产经验来进行，因此每次都会有一定的操作误差，这对结果带来一定的影响。

3 结论

通过额外添加酵母菌，实验室模拟发酵陶融型酒样，在酵母添加量达到1.50%的比例时，正丙醇生成量最低，产量降低了76.8%，在酵母添加量达到2.0%时，正丁醇生成量最低，产量降低了55.3%，异丁醇在酵母添加量为1.0%时，生成量最低，产量降低了72.2%，异戊醇在酵母添加量为1.50%时，产量最低，为0.517 g/L，比不添加酵母时异戊醇产量降低了47.6%。生产车间在添加1.50%酵母时，正丙醇产量比不添加纯种麸曲酵母时降低了49.1%，正丁醇产量比不添加纯种麸曲酵母时降低了28.8%，异丁醇产量比不添加纯种麸曲酵母时降低了11.4%，异戊醇产量比不添加纯种麸曲酵母时降低了16.9%。

近年来，有关通过酵母添加量的方法来降低原浆酒中高级醇含量的研究报道较少。本研究使陶融型原浆酒中高级醇总产量降低了55.68%，比孙金旭[13]在酵母添加量对酱香型白酒中杂油醇影响的研究中总高级醇产量降低了16.03%，比邢晓晰[16]利用纤维素酶在白酒生产中的应用研究总高级醇产量降低了40.86%，比罗惠波[17]通过酶制剂对浓香型白酒发酵过程中高级醇生成的影响研究中总高级醇产量降低了40.87%。本研究成本低，工艺简单，陶融型原浆白酒中高级醇的生成量降低显著，研究对生产陶融型白酒的指导意义重大。

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