抗菌肽对预防肉鸡坏死性肠炎的作用研究

张 琳， 张 江，熊海涛，关静姝

（ 1.林州中农颖泰生物肽有限公司，林州 456550；2.国家饲料工程技术研究中心，北京 100193；3.中国农业大学，北京 100085）

近年来，全世界主要养禽国家和地区都普遍存在产气荚膜梭状芽孢杆菌[1]。从全球范围来看，禽类养殖场梭菌疾病的发生率相当高，而在亚洲发生率更高。产气荚膜梭菌是典型的致病菌，有5种类型，即A、B、C、D、E型，能分泌包括α毒素及β毒素在内的12种外毒素对机体造成破坏。梭菌感染共分为以下几种类型：亚临床型梭菌感染、临床型梭菌感染和混合型梭菌感染。亚临床梭菌感染典型特征：粪样梭菌活菌计数＞104cfu·g-1，没有明显的表观症状，但是可以抑制生长性能及增加饲料损耗，但由于往往受到忽视，其损失持久巨大。研究表明，与健康鸡相比，亚临床坏死性肠炎（隐性梭菌感染）鸡体重会降低12%；料肉比会升高10.9%[2]。临床型的梭菌感染典型特征：粪样梭菌活菌计数＞106cfu·g-1，造成家禽的水便、坏死性肠炎等典型症状。混合型梭菌感染典型特征：与球虫的混合感染，肠道组织损伤是引发梭菌感染的有利条件，而肠道寄生虫特别是球虫，其对肠道上皮组织的破坏，往往引起梭菌的继发感染，造成梭菌-球虫循环恶化的级联反应[3]。

目前针对肠道健康，解决致病梭菌的问题，传统的方案是依靠抗生素。市场上常见使用的抗生素一般有恩拉霉素、维吉尼亚霉素、阿维拉霉素等。恩拉霉素在目前市场上为国产（山东胜利、浙江海正药业）和进口恩拉鼎，微生态制剂有美国建明的克洛生Clostrate粉剂、德固赛GutCare PY1等。总体来说，治疗梭菌药物属于价格比较高，占用饲料配方较大空间的药物。目前长时间大量使用抗生素带来的危害日益凸显，伴随着公众对抗生素应用的质疑，各国管理愈加严格，法规也日渐完善。减少抗生素使用，是当下畜禽饲料工业的迫切需要，也是食品安全的迫切需求。

抗菌肽（Antibacterial peptides）是生物体产生的一种先天性带有正电荷的阳离子多肽，具有先天性免疫作用。由于其独特的破膜杀菌机制，区别于抗生素，不易产生耐药性，同时能提高机体的免疫能力[4]。天蚕素抗菌肽最早由瑞典科学家Bo⁃man于1980年用大肠杆菌及阴沟通杆菌诱导惜古比天蚕蛹后发现该物质。

本试验产品梭力克TM是由中农颖泰集团开发的新型抗梭菌的抗菌肽——Ⅱ型天蚕素抗菌肽。其在原有天蚕素（命名为Ⅰ型天蚕素抗菌肽）分子的基础上，对氨基酸序列进行定向进化，得到的新型分子结构。其方法为通过诱变PCR，随机突变天蚕素DNA序列，使其对应的氨基酸序列发生变化，建立突变子文库，然后采用产气荚膜梭菌为指示菌进行高通量筛选，获得一种新型天蚕素，命名为Ⅱ型天蚕素抗菌肽。Ⅱ型天蚕素抗菌肽保留原来结构所具有的特点，还增强了对梭菌的杀灭效果。Ⅱ型天蚕素抗菌肽第28个氨酸由原分子的苯丙氨酸变为苏氨酸，并且由疏水性氨基酸变为亲水性氨基酸，改变了分子的极性，从而增强了其杀菌能力。梭力克的主要成分Ⅱ型天蚕素由37个氨基酸组成。通过生化和核磁共振的方法，发现其结构中含有两个α-螺旋和一个连接环。构成两个α-螺旋的分别是第6～16氨基酸残基和第26～35氨基酸残基，连接环为第17氨基酸～25氨基酸残基。其中，环状区域通过疏水作用力和氢键维持。

目前认为，梭力克通过以下方式抑制产气荚膜梭菌：通过抑制细菌的能量代谢而抑制了细菌的分裂；通过抑制NF-kb，提高CD4/CD8，促进sIgA来抑制梭菌；通过改变细胞膜的通透性，从而使细菌细胞膜破碎，内容物外渗，病原细菌死亡。

体外抑菌试验研究表明，Ⅱ型天蚕素抗菌肽可有效抑制产气荚膜梭菌，中农颖泰公司也成功将其进行产业化生产，因此抗菌肽对肉鸡坏死性肠炎的作用效果研究将会极大推动其在动物生产中的应用。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验采用单因子完全随机化试验设计，选择发育正常的1日龄AA肉仔鸡400只，随机分为4组，每组10个重复，每个重复10只鸡，各组间鸡只平均始重差异不显著（P＞0.05）。分别为对照组（基础日粮），低剂量梭力克组（基础日粮+梭力克100 g·t-1）、高剂量梭力克组（基础日粮+梭力克200 g·t-1）、恩拉霉素组（基础日粮+4%恩拉霉素250 g）。

1.2 试验日粮与饲养管理

肉鸡按日龄分为0～21日龄和22～42日龄两个阶段饲养，对照组和各处理组基础日粮与营养水平相同。肉鸡基础日粮组成及营养水平见表1。天蚕素抗菌肽——梭力克产品由中农颖泰集团提供。试验在南口试验基地进行，采用封闭式鸡舍3层笼养，室内温度按照AA肉鸡饲养标准控制。试验鸡自由采食和饮水，按照正常防疫程序适时接种鸡新城疫疫苗、传染性法氏囊疫苗。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生产性能指标测定

试验期间观察鸡只的健康状态，计算死淘率。分别于试验43 d早晨喂料前，对每个重复的鸡进行空腹称重。记录全期1～42日龄两个阶段的平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 粪便中产气荚膜梭菌的数量

于试验期21和42 d，每个重复采集当天新鲜粪便6份，每份约5 g，将每份粪样混合用于检测粪便中产气荚膜梭菌、乳酸杆菌及总耗氧菌的数量。

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS 20.0软件One Way ANOVA进行统计分析，并进行Duncan's多重比较，结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果分析

2.1 天蚕素抗菌肽对肉鸡生产性能的影响

天蚕素抗菌肽对肉鸡生产性能的影响见表2。

在整个试验期间，观察肉鸡粪便形态，各处理组粪便成形度优于对照组，且梭力克200 g试验组效果最佳。肉鸡全期的生产性能如表2所示，与对照组相比，恩拉霉素组、梭力克100 g组以及梭力克200 g组的肉鸡末重和日增重显著提高，料肉比显著降低（P＜0.05），且梭力克组较恩拉霉素组生产性能有所提高。各组之间日采食量无显著性差异（P＞0.05）。

表1 基础饲粮组成及营养水平 %

表2 天蚕素抗菌肽对肉鸡生产性能的影响

2.2 天蚕素抗菌肽对粪便中产气荚膜梭菌数量的影响

于42 d搜集各处理组肉鸡新鲜粪便，平板计数法测定粪便中产气荚膜梭菌数量。结果见表3。

由表3可知，与对照组相比，恩拉霉素组、100 g梭力克组以及200 g梭力克组粪便中梭菌数量显著降低（P＜0.05）；200 g梭力克组梭菌减少比例高达95.75%。

表3 天蚕素抗菌肽对粪便中产气荚膜梭菌数量的影响

3 讨论

目前，细菌对传统抗生素的耐药性问题已经受到广泛关注，因此研究人员开始积极寻找不易产生耐药菌株且效果较好的新型抗菌剂。截止到目前，发现的抗菌肽已有两千多种，其中包括动物、植物、真菌等产生的抗菌肽[5]。根据氨基酸组成、来源和结构特征，可将抗菌肽分为6大类：线性螺旋肽；富含包括碱性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基为特征的阳离子抗菌肽，多数呈α-螺旋结构；含有一个二硫键的环链结构抗菌肽；含有两个或更多二硫键，具有β-折叠结构的抗菌肽；来源于大蛋白的抗菌肽；由已知功能的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。天蚕素抗菌肽属于线性螺旋肽，根据Ceropin A和D设计合成的含37个氨基酸残基的杂合肽，以枯草芽孢杆菌为工程菌成功表达的基因工程产物[6]。

本试验研究表明，经过分子定向进化技术改造天蚕素抗菌肽分子结构，获得的Ⅱ型天蚕素抗菌肽，其对产气荚膜梭菌具有较好的抑制作用。目前认为，梭力克通过以下方式抑制梭菌：通过抑制细菌的能量代谢而抑制细菌的分裂，细菌的分裂过程是一个耗能的过程，细菌分裂时细菌的中部向内凹陷，一分为二形成两个细胞。其向内凹陷的原动力来源于GTP水解，GTP与FtsZ蛋白的结合被认为是产生细菌分裂原始动力最重要的一步。梭力克可调节3个关于能量代谢的蛋白表达：D-乳酸脱氢酶、丙酮酸转醛酶和磷酸烯酮丙酮酸羧激酶。减少细菌产生的ATP势必导致由GDP转化为GTP的量减少，使细菌不能完成分裂。通过抑制NF-kb，提高CD4/CD8，促进sIgA来抑制梭菌。通过改变细胞膜的通透性，从而使细菌细胞膜破碎，内容物外渗，病原细菌死亡，是抗菌肽普遍的杀菌机制。

本试验肉鸡养殖结束，收集肉鸡粪便，检测粪便中产气荚膜梭菌数量，发现各处理组粪便中产气荚膜梭菌数量均显著低于对照组，其中梭力克组显著降低高达95.75%。随着欧美等发达国家抗生素的禁用，产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎发病率普遍增高，尤其在潮湿的阴雨季节更易发生。该病不仅使动物生产性能降低、鸡群的死亡率也大幅增高，给养禽业造成巨大的经济损失[7-9]。试验结果表明，在肉鸡的生产性能方面，各处理组表现也均优于对照组，其中200 g梭力克组料重比相对于对照组显著降低，大幅提高养殖效益。

4 小结

试验结果表明，在肉鸡的生产性能方面，各处理组表现也均优于对照组，其中200 g梭力克组料重比相对于对照组显著降低（P＜0.05），大幅提高肉鸡养殖经济效益。

[参考文献]

[1] 郑晓丽,宋振银,倪学勤.产气荚膜梭菌对家禽业的危害及其预防[J]. 中国家禽,2008,30（24）:69-71.

[2] 李凯年.不同日粮蛋白对肉鸡亚临床坏死性肠炎的影响[J].中国动物保健,2010（5）:83.

[3] 董海亮,钟志成.球虫和梭菌在抗球虫病免疫接种肉鸡体内的相互作用[J].国外畜牧学-猪与禽,2004,24（4）:50-52.

[4] 朱勇,徐建雄.抗菌肽饲料添加剂的研究进展[J].饲料工业,2006,27（3）:14-16.

[5] 董丽娜,姜宁,张爱忠,等.天蚕素抗菌肽的研究与应用[J]. 黑龙江畜牧兽医,2017（9）:1-4,12.

[6] Yang D,Howard O M,Chen Qet al.Cutting edge:imma⁃ture dendritic cells generated from monocytes in the pres⁃ence of TGF-beta 1 express functional C-C chemokine re⁃ceptor 6[J].Journal of Immunology,1999,163（4）:1 737-1 741.

[7] 王寒笑.我国禽肉出口中的质量安全问题分析[J].中国家禽,2008,30（1）:51-52.

[8] 郑晓丽,倪学勤,曾东,等.鸡产气荚膜梭菌遗传多样性的REPPCR分析[J].中国兽医科学,2009,39（5）:383-388.

[9] 倪学勤,宋振银,曾东,等.四川地区鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定与基因分型[J].中国人兽共患病学报,2009,25（8）:737-740.