大豆凝集素的分离纯化及血凝效果研究
2018-04-25湛润生纪丽颖邢宝龙张旭丽
湛润生，纪丽颖，邢宝龙，张旭丽
(1.山西大同大学生命科学学院，山西大同037009;2.山西大同大学设施农业技术研发中心，山西大同037009；3.山西省农业科学院高寒区作物研究所，山西大同037008）
凝集素（agglutinin）是一类含糖（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用，广泛存在于各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物、人体以及某些病毒体内。常用的植物凝集素(PNA)，通常以其被提取的植物命名，如麦胚凝集素(WGA)、花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)等[1-4]。在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被（又被称为糖萼）。凝集素能与细胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成“桥”，从而引起细胞凝集[5－6]。
大豆凝集素（soybean agglutinin，SBA）是最早被描述的植物凝集素之一，利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，大豆凝集素在糖生物化学、血型鉴定、生物医药等领域有着广泛应用[7-11]。同时作为大豆中主要抗营养因子之一，大豆凝集素可对动物肠壁、刷状缘酶活性、小肠黏膜细胞代谢、肠道细菌生态物质代谢及免疫机能产生一定的影响[12]。因此开展大豆凝集素提取工艺及凝集活性检测实验尤为重要，本实验采用生理盐水提取的方法分离纯化得到大豆凝集素样品，并对其血凝活性进行了研究，旨在探索不同大豆凝集素含量的差异。
1 材料与方法
1.1 实验材料
大豆由山西省农业科学院高寒区作物研究所提供，分别是晋科5号、晋豆25号、长豆34号、晋遗57号和晋遗59号。
1.2 主要试剂
0.9 %NaCl溶液；肝素钠注射液（河南省国药医药有限公司）。
1.3 主要仪器
冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；电子天平（上海精科天美科学有限公司)；生物显微镜CKX41（日本OLYMPUS公司）；分光光度计（上海博迅实业有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备有限公司）。
1.4 实验方法
主要依据参考文献[13－15]进行。
1.4.1 大豆中凝集素的提取及其纯化
称取不同品种大豆10g，用0.9%NaCl溶液清洗干净，加入100 mL 0.9%NaCl溶液在4℃的冰箱中浸泡24h，用研钵将大豆研碎。在大豆粉中加入100 mL 0.9%NaCl溶液，置于4℃冰箱中放置一夜抽提。将大豆混合物用4层纱布过滤，将过滤好的滤液放到5 000 r∕min冷冻离心机中离心20 min。将上清液转移到烧杯中，4℃的冰箱中保存备用。
1.4.2 红细胞悬液的制备
以无菌方法抽取兔耳缘静脉血液（5 mL注射器先吸取3 mL 1%肝素溶液）1 mL，用0.9%NaCl溶液洗涤5次，每次3 000 r∕min离心5 min，最后按沉淀红细胞体积用0.9%NaCl溶液配成2%红细胞悬液。
1.4.3 血凝反应的测定
吸取大豆凝集素提取液和红细胞悬液各1滴在载玻片上，充分混匀，静置15 min，在光学显微镜下观察凝集效果。并用0.9%NaCl溶液作为空白对照，观察凝血效果。
1.4.4 凝集素相对含量的测定
1）将相同体积试管洗净灭菌后烘干称重，然后向各管内分别加入不同品种大豆凝集素提取液5 mL，并且用0.9%NaCl溶液做对照实验。
2）在各试管内同时加入1 mL的2%的红细胞悬液，充分摇晃均匀，15 min内观察红细胞的凝集情况。
3）在其中一种豆子中的红细胞团最先完全积淀的同一时刻，取出每个试管中的一部分上液，使每一个试管内的溶液都维持在同一刻度。与此同时再向各个试管内取2 mL的溶液于比色皿中，于分光光度计内测定其在620 nm时的吸光度值（OD）。
4）将每个试管中的溶液全部用胶头滴管取出，此时试管中只有红细胞凝块，然后再将试管放入烘干箱内烘干后称重。
1.4.5 凝集程度的判别与记录
试管内的溶液是清澈的，液体内的血红细胞在试管底部完全凝集后，轻轻摇晃试管时，可在试管内见到大的凝块，为高度凝集（++）；试管内的液体浑浊，试管底部可观察到较小的凝块，为轻度凝集（+）；试管内的液体中的红细胞分布均匀，试管底部未观察到凝块，为不凝集（－）。
2 结果与分析
2.1 细胞凝集反应
吸取凝集素提取液和红细胞悬液各1滴在载玻片上，混均，静置15 min，观察结果见表1。
表1 凝集素提取液与2%的红细胞悬液的凝集反应情况
可以看出，除0.9%NaCl、晋遗59号外，其他4种大豆凝集素提取液都使得红细胞悬液有不同程度的凝集。晋科5号、长豆34号使得红细胞凝集程度最高，证明其凝集素含量最高；晋豆25号、晋遗57号使得红细胞凝集程度次之，证明其凝集素含量相对较低。
2.2 发生凝集反应后上清液的吸光值
发生凝集反应后，在各试管内取2 mL溶液放入比色皿中，于分光光度计内测定其在620 nm时的吸光值（OD）。见表2。
表2 凝集素与2%红细胞悬液作用后上清液吸光值
当大豆中凝集素含量高时，凝集素使得溶液中的红细胞大量凝集，发生凝集反应后溶液澄清，吸光度值较小；反之，当凝集素含量低时，溶液中的红细胞较少凝集，溶液浑浊，吸光度值较大。总体来说，不同品种大豆凝集素含量顺序为：晋科5号＞长豆34号＞晋豆25号、晋遗57号＞晋遗59号。
2.3 凝集红细胞沉淀的干重
发生凝集反应后，用胶头滴管将试管内的溶液全部吸走，试管内余下红细胞凝块，将试管及血凝块一起放入烘干箱内烘干称重。
大豆中凝集素含量较高时，实验中血凝反应效果明显，红细胞的凝集团较大，最后所得凝集红细胞沉淀的干重较大。反之，凝集素含量低时，血凝反应的效果不明显，红细胞的凝集团较小，最后所得沉淀的干重较小。凝集素含量顺序为，晋科5号＞长豆34号＞晋豆25号＞晋遗57号＞晋遗59号。见表3。
表3 凝集红细胞沉淀的干重/mg
3 讨论与结论
本实验采用山西省广泛种植的几种大豆为实验材料，以0.9%NaCl溶液为提取剂。经过简单的前期提取过程，通过观察红细胞凝集状况，来初步区分凝集素含量的高低；再通过测定吸光度值和凝集红细胞干重，来进一步区分不同品种大豆凝集素相对含量的高低。实验过程表明，0.9%NaCl溶液作为提取剂对凝集素的活性影响较小，所得结果准确；兔血对血液的凝集反应也有较高的灵敏性。同时实验结果表明，不同品种大豆凝集素含量区分明显，晋科5号含量最高，长豆34号含量含量次之，晋豆25号和晋遗57号含量相对较低，晋遗59号含量最低。相信随着科技不断发展，新技术的不断涌现，今后对于大豆凝集素的提取方法会越来越精确，同时也会发现越来越多的关于大豆凝集素在生物学方面的应用。
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