Treg细胞及其细胞因子IL-10在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并急性脑梗死患者外周血中的动态表达研究*

刘 露，高 楠

1.河北省保定市第一中心医院神内2科 (保定 071000)，2.河北省保定市第一中心医院心内1科(保定 071000)

Treg细胞及其细胞因子IL-10在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并急性脑梗死患者外周血中的动态表达研究*

刘 露1，高 楠2

1.河北省保定市第一中心医院神内2科 (保定 071000)，2.河北省保定市第一中心医院心内1科(保定 071000)

*河北省保定市科技局科研项目(17ZF064)

目的：观察Treg细胞及其细胞因子IL-10在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)合并急性脑梗死(ACI)患者外周血中的动态表达，分析其与神经功能缺损程度之间的关系，探讨OSAHS对急性脑梗死的影响。方法：选取ACI患者160例，依据多导睡眠监测结果分为观察组(OSAHS合并ACI患者)86例，对照1组(单纯ACI患者)74例，发病后24 h及7 d、14 d进行NIHSS评分，同时抽取静脉血，另选健康体检者80例作为对照2组，抽取空腹静脉血1次，分别采用流式细胞术和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测三组各时期Treg细胞在外周血中所占的百分率，以及细胞因子IL-10的表达水平。结果：ACI发病后24 h、7 d及14 d，观察组及对照1组的Treg细胞百分率及IL-10水平均显著低于对照2组，差异有统计学意义，且均随时间呈逐渐上升趋势，各时间点差异显著，观察组各时间点Treg细胞百分率及IL-10水平均显著低于对照1组，差异有统计学意义(P均<0.05)。ACI发病后24 h、7 d及14 d，观察组及对照1组的NIHSS评分均随时间呈逐渐下降趋势，观察组NIHSS评分各时间点均显著高于对照1组，差异有统计学意义(P均<0.05)。结论：OSAHS合并ACI患者外周血Treg细胞百分率及其细胞因子IL-10的表达水平较单纯ACI患者显著降低，呈动态变化过程，且与神经功能缺损程度可能相关。

脑梗死目前通常被认为由动脉粥样硬化闭塞导致局部血栓形成，引起局部脑组织出现缺血、缺氧，发生氧化应激反应，造成脑损伤甚至坏死，导致相应部位的神经功能缺损。

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstructivesleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是一种常见疾病，与许多心脑血管疾病的病理过程有关，包括高血压和心律失常，也被认为是脑卒中的独立危险因素。OSAHS在脑卒中和短暂性脑缺血发作患者中普遍存在[1]。但OSAHS导致ACI的具体机制目前尚不明确。近年研究发现，Th17/Treg细胞失衡在急性脑梗死的发生发展过程中发挥着重要的作用。Treg细胞分泌IL-4、IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子，抑制效应T细胞增殖及合成细胞因子，发挥抗炎作用[2]。有研究显示, OSAHS与CD4+CD25+Treg也可能具有内在联系[3]。本研究通过比较合并OSAHS的ACI患者与单纯ACI患者发病后不同时间点NIHSS评分，以及外周血中Treg细胞的百分率、IL-10含量的动态变化，进一步明确Treg细胞及其细胞因子IL-10在OSAHS相关的ACI的发病过程中的作用。

资料和方法

1 一般资料 连续纳入2015年7月至2017年6月我院神经内科收治的首发急性脑梗死患者160例，其中男性81例，女性79例，年龄为45～75岁，平均(58±11)岁。纳入标准：①ACI的诊断标准，符合中国急性缺血性卒中诊治指南2014，且经头颅MRI确诊；②既往无脑卒中病史；③症状出现6h内住院治疗。排除标准：①既往存在脑出血、脑梗死、蛛网膜下腔出血病史和(或)既往检查发现颅内肿瘤或脑动静脉畸形者；②病情危重或有意识障碍，伴有认知功能障碍和严重言语障碍、听理解障碍者，或急性脑梗死合并舌后坠患者；③符合溶栓指征且需要溶栓患者；④住院期间合并感染或近4周内存在感染、外伤、手术史，既往长期和(或)近4周服用抗炎药物、免疫抑制剂者；⑤合并肝、肾、心、肺等重要脏器功能不全，恶性肿瘤、内分泌疾病、血液及免疫系统疾病者；⑥精神障碍既往史或家族史阳性，或不能配合睡眠检测者；⑦随访丢失的患者。同期纳入我院同年龄段健康体检者80例作为健康对照，排除打鼾或睡眠呼吸暂停综合征。与急性脑梗死组患者在年龄、性别等一般资料无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法 研究材料有流式细胞仪CytomicsFC 500(Beckman Coulter，美国)，鼠抗人CD4-FITC(BD Phar Mingen，美国)，鼠抗人CD25-PE及同型对照(BD Phar Mingen,美国)，IL-10试剂盒(RD，美国)。ELISA试剂盒购自美国R&D公司。

2.1 入院后常规治疗方法：160例急性脑梗死患者入院后均给予抗凝、抗血小板聚集、稳定斑块、脑保护、改善循环等治疗，合并糖脂代谢紊乱时给予降脂、控制血糖、血压等治疗。

2.2 NIHSS评分：急性脑梗死患者入院当时及发病第7天、第14天由经过培训的神经科医生进行美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分。

2.3 睡眠呼吸监测：所有急性脑梗死患者于入院当晚行整夜睡眠呼吸监测(PSG)。监测当日禁用镇静剂，禁饮酒、咖啡、浓茶等影响睡眠物质，于21∶00进入监测室进行PSG监测，次日由专科医师对各项指标进行手工分析。

2.4 分组：依据OSAHS诊断标准及PSG监测结果将所有急性脑梗死患者分为观察组(合并OSAHS的ACI患者)86例，对照1组(单纯ACI患者)74例，健康体检者作为对照2组。三组对象的性别、年龄差异无统计学意义。

2.5 外周血Treg细胞检测:观察组和对照1组受试者于发病后24 h、7 d、14 d，抽取静脉血共5 ml，对照2组受试者只抽1次静脉血，分成2份，一份注入EDTA-K2抗凝管，行流式细胞仪相关标记:取清洁试管3支，第1支加入FITC及 PE标记的同型对照各10 μl，第2支加入FITC标记的CD4单抗和PE标记的同型对照各10 μl，第3支加入CD4-FITC单抗和CD25-PE单抗各10 μl，然后每管加入50 μl抗凝外周血，室温避光孵育20 min，加入红细胞裂解液2 ml，室温避光5 min，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤1次，最后加入1%多聚甲醛300 μl进行固定。

2.6 流式细胞仪检测：校准流式细胞仪的光路和液路，对淋巴细胞设门，FL1和FL2荧光通道以相应同种型的鼠IgG染色细胞作阴阳分界线，仔细设置各荧光通道之间的荧光补偿，然后检测CD4及CD25，将荧光强度超过102的CD25阳性细胞定义为CD25+细胞，每管获取CD4+细胞2 000～4 000个，用CXPSoftware软件进行分析,所得Treg细胞百分率。

2.7 外周血IL-10水平检测：另一份静脉血，3000 r /min离心5 min，收集血清，-80 ℃冰箱短期保存待测。IL-10的检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)，实验严格按照试剂说明书进行。准备好各种试剂，各孔中加入50 ml AssayDiluent RD1W，然后分别加入标准液、血清样品和对照200 μl，37 ℃孵育2 h；吸去液体，用清洗液洗4次；加入200μl IL-6 Conjugate，37 ℃孵育1h;吸去液体,用清洗液洗4次；加入Substrate Solution 200μl，37 ℃避光孵育20 min；加入50μl Stop Solution于各孔中，半小时内上酶联免疫检测仪检测，波长取450 nm。

结 果

1 外周血Treg细胞百分率变化 急性脑梗死发病后24 h、7 d及14 d，观察组及对照1组受试者Treg细胞百分率均显著低于对照2组，观察组及对照1组受试者Treg细胞百分率均随时间呈逐渐上升趋势，各时间点差异具有统计学意义(P<0.05)。观察组的Treg细胞百分率各时间点均显著低于对照1组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2 外周血IL-17水平 急性脑梗死发病后24 h、7 d、14 d，观察组及对照1组受试者IL-10水平均显著低于对照2组，观察组及对照1组受试者IL-10水平随时间呈逐渐上升趋势，各时间点差异显著；急性脑梗死发病后24 h、7 d、14 d，观察组IL-10水平均显著低于对照1组，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

3 NIHSS评分比较 急性脑梗死发病后24 h、7 d、14 d，观察组及对照1组受试者NIHSS评分随时间呈逐渐下降趋势，各时间点观察组的NIHSS评分均显著高于对照1组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表3。

表1 三组外周血Treg细胞百分率比较(%)

注：各组内各时间点比较，及各时间点两组间比较，P均<0.05

表2 三组外周血IL-10水平比较(ng/L)

注：各组内各时间点比较，及各时间点两组间比较，P均<0.05

表3 两组NIHSS评分变化(分)

注：各时间点两组间比较，P均<0.05

讨 论

1 Treg细胞与脑梗死 缺血性脑卒中可引发庞大的免疫反应，包括固有免疫和适应性免疫。固有免疫细胞包括中性粒细胞和小胶质细胞/巨噬细胞，他们的过度活化会释放大量的细胞毒性分子，产生基质金属蛋白酶(MMPs)，破坏血脑屏障完整性，允许更多的外周免疫细胞入侵。同时，由活化的炎性细胞产生的细胞因子和化学分子又进一步补充进来，并活化更多的免疫细胞，促进脑组织持久性的损失并加重神经功能缺损[4]。

适应性免疫系统的成员，特别是T淋巴细胞在缺血性脑损伤中也发挥了重要作用。调节性T细胞(Tregs)是一类特殊的T细胞亚群，它作为一种内源性的保护机制抑制缺血性脑卒中后的炎性反应。CD4+、CD25+Tregs可负向调节免疫系统，以及调节病原体和损伤导致的炎症反应。Tregs通过直接接触或释放免疫抑制因子TGF-β和IL-10，抑制效应性T细胞和其他免疫细胞[4]。

有研究表明，缺血性脑卒中患者卒中发生7d和28d循环中Treg细胞数量明显低于对照组，卒中后28 d Treg细胞比例明显高于卒中后7 d，但仍显著低于对照组；IL-10水平在卒中后7d显著减少，但在卒中后28 d显著增加，但仍低于对照组[5]。本研究中我们检测了急性脑梗死患者不同时间点外周血中Treg细胞百分率以及血清中IL-10的水平，结果显示，观察组和对照1组患者Treg细胞百分率及IL-10水平各时间点均显著低于对照2组(健康人群水平)，提示Treg细胞及其细胞因子IL-10的减低可能与急性脑梗死的发生有关。脑卒中患者和实验动物在发生卒中几天后外周血中可检测Treg细胞含量的增加。我们的实验中可以看到急性脑梗死发生后24 h、7 d、14 d，观察组和对照1组受试者Treg细胞百分率及IL-10水平随时间呈逐渐上升趋势。有研究表明，在大脑中动脉栓塞模型建立2 h，6 h甚至24 h后，系统的给予纯化的Treg细胞，可明显减少导致脑梗死事件的发生，并将神经功能修复的时间延长至4周以上[4]。在永久性大脑中动脉闭塞模型中，与野生型小鼠相比，IL-10基因敲除(IL-10 KO)的小鼠致死率更高[6]。预先转入重组腺病毒载体的IL-10基因至雄性Wistar大鼠的左侧大脑中动脉(对照组转入相同载体的标记荧光蛋白或生理盐水)，3周后在左侧大脑中动脉栓塞45 min后再次给予缺血再灌注24 h，前者可导致神经功能缺损评分下降，脑梗死体积明显缩小，受损神经细胞数量减少[7]。因此我们的实验中看到观察组Tregs的百分率及IL-10水平随急性脑梗死病程延长呈逐渐上升趋势，而NIHSS评分呈逐渐下降趋势，提示在脑梗死发生急性期，随病程延长Treg细胞被大量活化，释放大量的IL-10，发挥抑制炎性反应的作用，从而促进组织修复及炎症的好转。

2 Treg细胞与OSAHS OSAHS是多种病因导致睡眠过程中反复出现上呼吸道塌陷，进而导致上呼吸道部分或完全阻塞、气流受限。因其造成了反复低氧和高碳酸血症，进而导致了氧化应激反应的发生，因此成为心脑血管疾病的又一危险因素[8]。赵慧新等人研究表明，ACI合并OSAHS患者存在更高的炎症反应及内皮功能障碍[9]。

本研究中我们检测了OSAHS合并ACI患者不同时间点外周血中Treg细胞百分率以及血清中IL-10的水平，结果显示均显著低于对应时间点的单纯ACI患者。提示OSAHS合并ACI患者脑梗死病程中，参与炎症反应过程的Treg细胞减少，同时释放的IL-10减少。但观察组NIHSS评分相同时间点均显著高于对照1组，考虑NIHSS评分的增高与Treg细胞及其细胞因子IL-10的减低有关。随病情发展及恢复，Treg细胞百分率及IL-10水平逐渐上升，呈动态演变过程，同时组内各时间点NIHSS评分比较呈显著降低趋势，考虑Treg细胞及其细胞因子的IL-10水平的变化与炎症修复有关。但14 d脑梗死病程进入恢复期时OSAHS合并ACI患者Treg细胞及其细胞因子的IL-10水平仍低于单纯ACI患者，且NIHSS评分显著高于单纯ACI患者，考虑OSAHS合并ACI患者脑梗死病程急性期后期组织修复不良，导致预后不佳。

综上所述，Treg细胞及其细胞因子IL-10参与了OSAHS合并急性脑梗死患者脑梗死的发生、发展及恢复阶段的炎症反应过程，且其介导的炎症反应更重，神经功能缺损程度更重，恢复更差，推测与炎症反应导致的Treg细胞减少，分泌细胞因子IL-10减少，从而破坏了免疫平衡可能是此类患者病情发展的原因之一，为此类患者进一步的治疗提供新的靶点。

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[5] Hu Y, Zheng Y, Wu Y,etal. Imbalance between IL-17A-producing cells and regulatory T cells during ischemic stroke [J]. Mediators Inflamm, 2014, 2014: 813045.

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(收稿：2017-08-02)

DynamicchangesofTregcellsandIL-10inperipheralbloodinpatientswithacutecerebralinfarctionandOSAHS

Liu Lu,Gao Nan.Baoding No.1

Central Hospital of Hebei Province(Baoding 071000)

Objective:To observe the dynamic changes of Treg cells and interleukin-10(IL-10)in peripheral blood of patients with acute cerebral infarction and OSAHS, analyze their relationship with neurological impairment,and investigate the effect of OSAHS to ACI.Methods 160 patients with ACI were selected and divided into two groups according to PSG results.86 patients with ACI and OSAHS were enrolled in research group,and 74 patients with only ACI were enrolled in control group 1.NIHSS score was used to evaluate the neurological deficits at 24h,day 7 and day 14 after symptom onset. 3ml whole blood of each patient was collected at the same time.Flow cytometry and enzyme-linked emmunosorbent assay(ELISA)were used to detected the percentage of Treg cells and IL-10 level in peripheral blood.80 healthy people underwent physical examination were selected as control group 2.The 3ml whole blood was also collected,and the percentage of Treg cells and the IL-10 level were also detected.Results:1.The percentage of Treg cells and the IL-10 level of research group and control group1 were significantly lower than control group2 at 24h,7days and 14days after acute cerebral infarction.The trend was gradual rised with time.The results at each time spot were significantly different.The percentage of Treg cells and IL-10 level of research group were significantly lower than control group1 (P<0.05).2.The NIHSS scores of research group and control group 1 were gradually decreased from 24h,7days to 14 days after acute cerebral infarction.The NIHSS score of research group was higher than that of control group at each time spot.The difference was significant(P<0.05).Conclusion: The percentage of Treg cells and IL-10 level of patients with OSAHS and ACI are significantly lower than patients with only ACI.The results changed dynamically.Those were relative with the level of neurological impairment.

Sleep apnea,Obstructive Hypoventilation Brain infarction/physiopathology @Treg cell Interleukin-10

睡眠呼吸暂停,阻塞性 通气不足 脑梗塞/病理生理学 @Treg细胞 白细胞介素10

R362.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.006