ELISA法检测HIV抗体的影响因素和控制对策分析

付晶鑫

（盘锦市中心血站检验科，辽宁 盘锦 124000）

酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种常用的固相免疫测定方法，在各种抗原及抗体检测中都有广泛的应用。2009年修订版《全国艾滋病检测技术规范》中要求：在进行抗体检测时，首先用高敏感性ELISA法检测，出现阴性反应则报告为HIV抗体阴性，出现阳性反应则使用高特异性ELISA试剂进行复检。目前，在基层HIV抗体初筛实验中ELISA法被普遍运用，但该检测方法受多种因素影响，分析ELISA法检测HIV抗体的影响因素并实施有针对性的质量控制措施十分必要[1-2]。本次研究选取进行HIV抗体阳性检验的2500例标本行ELISA法检测，将初筛试验中的5例（0.2%）阳性标本送至市疾病预防控制中心实验室予以确认，分析整个ELISA法检测过程，从标本来源、试剂、样本、操作过程着手，提出有效质量控制措施。

1 资料与方法

1.1 标本来源：收集2017年1～6月进行HIV抗体阳性检验的2500例血液标本行ELISA法检测。

1.2 仪器和试剂：使用芬兰雷勃MK3酶标仪、TECAN洗板机以及移液器。试剂为人类免疫缺陷病毒（HIV）1+2型抗体诊断试剂盒酶联免疫双抗原夹心法，试剂由珠海丽珠试剂股份有限公司提供，生产批号：国药准字S20120018。

表1 （HIV）1+2型抗体诊断质控结果

1.3 检测方法：ELISA检测严格按照操作说明和《全国艾滋病检测技术规范》要求进行，并判断结果，采用双波长450 nm/630 nm，临界值为cut off=0.1+N（阴性对照均值），标本A值＜cut off值则判定为阴性，≥cut off值则判定为阳性；当阴性对照A值＜0.02，则按0.02进行计算；阳性对照A值＜0.5，阴性对照A值＞0.1，则实验失败[3]。血液标本均分别连续进行4次测定。

2 结 果

2.1 检测结果：2500例血液标本行ELISA法检测，将初筛试验中的5例（0.2%）阳性标本送至市疾病预防控制中心实验室予以确定，经确定只有1例（0.04%）被确定为HIV抗体阳性，其余为阴性，初筛试验阳性准确率为20.00%。（HIV）1+2型抗体诊断质控结果见表1。血液样本ELISA法检测HIV抗体4次结果见表2。

表2 血液样本ELISA法检测HIV抗体4次结果

2.2 ELISA法检测HIV抗体影响因素：经追溯分析发现，在ELISA法检测HIV抗体的整个过程中影响因素涉及到各个环节，主要有：标本、试剂、温度、人员操作技术等诸多因素。4例假阳性标本中，1例为血液标本处理不当，受到高浓度非特异性免疫球蛋白的影响，导致假阳性；2例标本发生溶血，1例标本被污染。

3 讨 论

ELISA法检测HIV抗体影响因素涉及各个环节，主要包括有标本、试剂、温度、人员操作技术等诸多因素，针对影响因素制定有针对性的控制措施是减少和避免假阳性的关键。

3.1 标本内源性及外源性干扰和处理：内源性干扰因素包括了补体、类风湿因子、高浓度非特异性免疫球蛋白等，这些因素往往会造成检验结果的假阳性或者假阴性，解决措施为：对标本应用0.01 mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）进行1∶1稀释，并于温度56 ℃下进行血清灭活（30 min）[4]。外源性干扰因素包括有血液标本采集、保存和运送等环节操作不当所造成的标本溶血、污染、长时间贮存、加入抗凝物质等，解决措施有：①标本采集过程中要尽可能防止溶血；②标本采集后，于室温自然放置1～2 h，等血块收缩、凝固后离心，并将血清吸出；③对血清标本立即检测，标本无法立即检测的要置于4 ℃保存，若放置时间需要1周以上的则将标本置于-20 ℃保存；④在加入抗凝物质到标本中时，尽可能不使用酶抑制剂，避免ELISA中的酶活性降低[5]。

3.2 试剂：①试剂的选择：ELISA法进行HIV抗体检测的试剂盒必须经过注册批准，并且检验合格，在有效期内。在试剂盒选择时要根据鉴定报告、临床评估结果、室间质评评估结果，选择高灵敏性、高特异性的试剂。②预处理：检测时要做好对试剂的预处理，这往往是检验人员比较容易忽略的步骤，在每一次实验之前要从冰箱将试剂盒拿出并在室温放置平衡约30 min，确保使用之前，试剂的温度与室温基本一致，进而避免对抗原抗体结合和反应速度造成影响[6]。③确保试剂盒对照质控品的有效性：内部对照只能在同批号试剂盒中使用，如果无效，则需要重新实验。

3.3 仪器及操作：①加样：在HIV抗体的检测中必须严格按照《全国艾滋病检测技术规范》操作，避免交叉污染的发生，操作人员穿好工作衣，戴好手套，严格消毒隔离。在加样时正确使用移液器（定期校正）加入规定的量于孔内，注意不要加样到孔壁的边缘位置，吸头避免碰到包被的抗原，加样要做到慢吸快放（避免气泡和溅出）。在每次加样后更换吸头，杜绝交叉污染。试剂滴加时先摇匀滴瓶并将第一滴挤去再滴加，注意不要产生气泡。②温度：在ELISA法检测中，温度是一个重要的问题，对实验成败起着决定性的作用，因此要控制好温度。首先是设置好恒温箱的温度，不仅要确定恒温箱面板显示的温度，为了避免实际温差，需要在箱内使用温度计，观察准确的温度。然后要确保抗原抗体在设定温度下反应足够的时间，最适反应温度为37 ℃，需要经过一定时间方可达到平衡点[7]，因此温育通常采用的是水育法，温育时水要处于板条1/3的位置，为了确保温度平衡一致，因此板条不能叠加放置。③洗板：待检测血清标本中可能存在HIV病毒，为了保证检验人员的安全并防止环境污染，在检测HIV抗体时要尽可能的用洗板机洗板，采用ELISA法检测HIV抗体过程中，洗板是一个十分关键的环节，对检验结果有直接的影响。根据说明书的要求对浸泡时间和洗涤次数进行设置，并在完成洗涤后拍板，并对管道用蒸馏水冲洗防止堵塞；各种试剂盒的洗涤液避免混用；在使用不同厂家酶标板时要对吸液头高度进行调整，避免在酶标板中卡住；及时更换有破损的吸液针头。

3.4 显示与结果观察：严格按照规定的时间、温度、反应终止，并在显色反应终止后立即使用酶标仪比色，在15 min内完成判读。

3.5 复检和质控：在复检时要使用原试剂与另一厂家不同原理的试剂，检验结果HIV抗体为阳性或者一阴一阳则送至艾滋病确证实验室确证，若均为阴性则报告HIV抗体阴性。质控可采用“即刻法”[8]，即同一质控血清连续测定3次后对最后一次结果质控，一旦实验数据处于警告、失控状态则要立即找出原因，对实验的各个环节进行追溯分析，针对性的解决问题。

综上所述，在ELISA法检测HIV抗体的初筛试验中，要消除操作中的各种影响因素，进而有效地避免筛查中的假阳性或者假阴性，保证检验结果的准确性。

[1]黄雁,陈兴智.HI实验室检验技术及效果分析进展[J].中国医药指南,2012,10(3):51-53.

[2]孙爱琴.ELISA法检测HIV抗体的影响因素和控制措施[J].河南预防医学杂志,2012,23(4):270-272.

[3]张杰.影响ELISA法检测HIV抗体准确性的若干因素和质控研究[J].临床医学研究与实践,2016,1(16):119.

[4]胡伯胜. ELISA法检测HIV抗体质量控制方法的应用比较[J].国际检验医学杂志,2013,34(24):3391-3392.

[5]王永.探讨ELISA法在HIV抗体检测中的危险因素分析[J].中国保健营养,2015,25(15):379-380.

[6]李志明.ELISA法检测HIV抗体影响因素分析[J].中外医疗,2011,30(5):191-192.

[7]乔健健.直接ELISA法与间接ELISA法检测HIV抗体的对比分析[J].中国实用医药,2012,7(21):111-112.

[8]王雪梅,李代渝,江灵,等.溶血对ELISA与化学发光免疫检测HIV抗体的影响[J].现代检验医学杂志,2014,29(2):94-96.