17-AAG联合吉西他滨对人胰腺癌BxPC-3细胞株增殖的影响

戴树龙 马海青 李斐 杨坤兴

吉西他滨(gemcitabine, GEM)单药化疗为晚期胰腺癌的标准一线治疗，但疗效欠佳，耐药是导致化疗失败的主要原因[1]。HSP90是一种分子伴侣蛋白，参与蛋白质的聚集、折叠、装配及转运等过程，与胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等多种恶性肿瘤的发展都有密切的关系[2]。17-AAG是HSP90的特异性抑制剂，对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用，成为治疗的新靶点。本研究采用CCK-8法测定不同时间、不同浓度的17-AAG、GEM及两者联合用药对人胰腺癌BxPC-3细胞株增殖的抑制作用，为中晚期胰腺癌患者提供新的联合化疗方案和理论依据。

一、材料与方法

1．细胞培养及分组： 人胰腺癌细胞株BxPC-3购自南京凯基生物公司，常规培养传代。取对数生长期细胞，以3×104个/ml的密度接种于96孔板，每孔200 μl，分为空白组、对照组、17-AAG组、GEM组、联合用药组。空白组只加培养液；对照组为不加药的BxPC-3；17-AAG组分为终浓度10.0、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/ml 17-AAG的各组；GEM组分为终浓度10.0、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/ml GEM的各组；联合用药组按照单药组的浓度梯度联合应用17-AAG和GEM。每组设5个复孔。17-AAG购自美国SANTA公司，GEM由南京市第一医院肿瘤科提供。

2．CCK-8法检测细胞增殖抑制率： 上述各组细胞分别培养24、48 h后每孔加入5 mg/ml CCK-8液20 μg，继续培养4 h。上酶标仪测定各孔在波长490 nm处的吸光值(A490值)，以空白组调零。细胞增殖抑制率=(对照组A490值-实验组A490值)/ 对照组A490值×100%。实验重复3次，取均值。

二、结果

17-AAG组、GEM组及联合用药组均呈浓度及时间依赖性抑制BxPC-3细胞的增殖。与对照组相比，不同浓度的17-AAG、GEM对BxPC-3细胞作用24 、48 h后均有抑制作用(图1、2)；随着药物浓度的增加，其产生的抑制效果越明显(P<0.05)。作用48 h各组对BxPC-3细胞增殖的抑制率高于24 h各组；联合用药组24、48 h时对BxPC-3细胞增殖的最高抑制率分别为65.1%及83.2%，显著高于单独用药组，差异有统计学意义(P<0.05)。

讨论胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，85%的患者就诊时已属晚期，手术切除率仅10%～15%，5年生存率仅1%～5%[3]。GEM常用于中晚期胰腺癌的化疗，但易产生耐药。Derong等[4]研究表明，细胞外信号调节激酶(ERK)参与调节多重耐药基因(MDR-1)和核糖核苷还原酶(RRM1)的表达改变可能与胰腺癌对GEM的抵抗有关。

图1 24 h时各实验组药物对人胰腺癌BxPC-3细胞增殖的抑制率

图2 48 h时各实验组药物对人胰腺癌BxPC-3细胞增殖的抑制率

HSP90在多种肿瘤组织中呈高表达状态。李亮等[5]发现胰腺癌组织中HSP90的表达不仅明显高于正常组织，且其表达还与淋巴转移及临床分期相关。17-AAG是HSP90的特异性拮抗剂，目前已进入了临床应用，在实体肿瘤及白血病的临床治疗中均有不错的效果[6]。一方面，17-AAG通过增加抑癌基因p53的表达从而发挥抗肿瘤作用[7]；另一方面，17-AAG可减轻肺癌患者对放疗药的耐药性，明显增强其治疗效果[8]。因此，17-AAG可能还可以通过调节ERK通路增强胰腺癌患者对GEM的敏感性。

本研究通过CCK-8法证实联合应用17-AAG与GEM对胰腺癌BxPC-3细胞增殖的抑制率明显高于单独用药组，在48 h时最高可达83.2%。但目前的结果仅限于细胞水平的研究，本课题组还将进一步建立胰腺癌裸鼠动物模型来评估联合用药在体内实验中的效果及安全性，并测定与肿瘤相关的HSP90伴侣蛋白胰岛素样生长因子、表皮生长因子受体、磷脂酰激酶-3-激酶及酪氨酸激酶的表达，进一步探讨17-AAG和GEM联合用药的抗癌机制，为胰腺癌联合化疗的可行性提供新的实验室依据。

[1] 王羽,梁汉霖,郭双双,等.正在进行的晚期胰腺癌临床试验.中国肿瘤临床,2005,32(20):1197-1199. DOI:1000-8179(2005)20-1197-03.

[2] Pandey P, Saleh A, Nakazawa A, et al. Negative regulation of cytochrome c-mediated oligomerization of Apaf-1 and activation of procaspase-9 by heat shock protein 90[J].EMBO J,2000,19(16):4310-4322. DOI:10.1093/emboj/19.16.4310.

[3] 潘博,郭俊超,廖泉,等.吉西他滨与胰腺癌化疗耐药. 中国普外基础与临床杂志,2005,12(5):530-532. DOI:1007-9424(2005)05-0530-03.

[4] Derong Xie, Denglin Chen, Shuangshuang Guo, et al. ERK signaling pathway may induce gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer cell line SW1990 by regulating the expression of mdr-1 and RRM1 gene.Chinese-German Journal of Clinical Oncology, 2009, 8(1):37-41. DOI:10.1007/s10330-008-0145-5.

[5] 李亮,刘建生,李春晓.胰腺癌组织中HSP90和IGF-1R的表达及临床意义[J].中国热带医学,2009,9(12):2247-2248. DOI:1009-9729(2009)12-2247-02.

[6] Iyer G, Morris MJ, Rathkopf D, et al. A phase I trial of docetaxel and pulse-dose 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin in adult patients with solid tumors[J]. Cancer Chemother Pharmacol,2012,69(4):1089-1097. DOI:10.1007/s00280-011-1789-3.

[7] García Martínez J, García-Inclán C, Suárez C, et al.DNA aneuploidy-specific therapy for head and neck squamous cell carcinoma[J].Head Neck,2014,Mar13.[Epub ahead of print]. DOI:10.1002/hed.23687.

[8] Noguchi M, Yu D, Hirayama R, et al. Inhibition of homologous recombination repair in irradiated tumor cells pretreated with Hsp90 inhibitor 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,351(3):658-663. DOI:10.1016/i.bbrc.2006.10.094.