浙北地区334例甲真菌病真菌培养结果分析

潘 露 胡丽华 陶亦帆 杨 波

甲真菌病由真菌侵犯甲板所致，是皮肤科常见的浅部真菌病之一。近年来，随着生活水平的不断提高，广谱抗生素的滥用、免疫抑制剂及糖皮质激素使用的增多、甲真菌病的发病率呈上升趋势，致病菌种分布也发生变化，且菌种分布存在一定的地域差异。为了解浙北地区甲真菌病致病菌种分布特征，本研究对2016年1～12月来我院就诊的甲真菌病病人的真菌培养结果进行分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病例及标本来源 所有病例均是2016年1～12月来我院就诊的临床初诊为甲真菌病患者，其中1007例真菌镜检阳性的标本进行真菌培养，334例培养阳性,阳性率33.17%。平均年龄42.5岁。

主要试剂与仪器 试剂：含氯霉素(0.005 g/100 mL)和放线菌酮(0.05 g/100 mL)沙保罗氏琼脂(杭州滨和微生物试剂有限公司)，梅里埃(上海)生物制品有限公司生产的酵母菌鉴定培养基(CAN2),乳酸酚棉兰染液。

仪器：CX-31荧光显微镜(OLYMPUS),低温恒温培养箱(MIP-154)，海尔医用冷藏箱(HYC-68A)，力康生物安全柜(HFsafe-1200LC)，三洋高压蒸汽灭菌器(MLS-3750)。

1.2 方法

1.2.1 直接镜检 选择病变最严重的病甲作为靶甲， 取材前先用75%酒精棉拭彻底清洁后，用无菌钝手术刀刮取表层，采集病甲边缘下的较深层(贴近甲床)的甲屑置于载玻片上，用10% KOH溶解病甲屑制成片，在酒精灯火焰上微加热，直接在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，初步判断致病菌。

1.2.2 真菌培养与菌种鉴定 将甲屑标本接种于含氯霉素和放线菌酮的沙保斜面培养基中(SCCA)，每管至少接种3点。25℃～28℃培养2周，隔1～2天观察生长情况，皮肤癣菌和非皮肤癣菌的鉴定根据菌落形态、培养基颜色变化和小培养的镜下结构，主要依据大分生孢子的特征进行菌种鉴定。小培养的镜下结构运用乳酸酚棉蓝染色后菌丝和孢子呈深蓝色，形态结构更加清晰，背景干净，反差大。乳酸可杀灭真菌，棉蓝可使其着色，甘油可使玻片长期保存[1]。

酵母菌通过梅里埃(上海)生物制品有限公司生产的酵母菌鉴定培养基的颜色来鉴定。

1.3 统计学方法 本研究所得数据均通过SPSS 19.0统计学软件进行分析和处理，数据组之间的比较采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病原菌的构成比例 1007例甲真菌镜检阳性患者进行真菌培养,334例培养阳性,阳性率33.17%.其中感染病原菌菌种以皮肤癣菌为主，共148例(44.31%)，其中红色毛癣菌最多，有136例(40.72%)，其次是非皮肤癣菌中的曲霉(14.67%)，酵母菌中的白念珠菌(10.48%)，详见表1。

2.1.1 甲真菌病患者致病菌菌种性别分布情况 334例真菌培养阳性患者中，男121例，女213例。男性以皮肤癣菌为主，占46.28%，女性同样以皮肤癣菌为主，占43.19%，男女病原菌分布差异无统计学意义(χ2=0.59,P=0.745)。详见表 2。

2.1.2 甲真菌病患者病原菌菌种的年龄分布情况 334例真菌培养阳性的患者中，36～55岁年龄段，甲真菌病患者最多，其中以皮肤癣菌感染最多有65例(39.16%)，>55岁以酵母菌感染为主有29例(48.33%)，各个年龄组病原菌菌种分布不同，差异具有统计学意义(χ2=23.94，P<0.01)，详见表 3。

表1 真菌培养阳性的334例甲真菌病中分离的病原菌种类及构成比例

表2 男女甲真菌病患者病原菌分布情况 例(%)

表3 甲真菌病患者病原菌年龄分布情况 例(%)

2.1.3 甲真菌病患者不同甲部位感染病原菌种类的对比 不同病原菌菌种在感染的部位总体上具有统计学差异(χ2=51.86，P<0.01),其中皮肤癣菌与酵母菌比较感染部位存在统计学差异(χ2=51.54，P<0.01),指甲更易受酵母菌感染(52.34%)，趾甲更易受皮肤癣菌感染(58.74%);皮肤癣菌与非皮肤癣菌比较感染部位差异也有统计学意义(χ2=16.65，P<0.01)。酵母菌与非皮肤癣菌比较感染部位差异有统计学意义(χ2=6.21，P=0.013)，详见表 4。

表4 甲真菌病患者不同甲部位感染病原菌种类 例(%)

2.2 甲真菌病患者各年龄段的性别分布情况 334例真菌培养阳性标本中，男121例，女213例，男女比例为1∶1.75，36～55岁组的甲真菌病患者最多，其中主要是女性患者有122例(36.53%)，甲真菌病患者各年龄段性别分布有差异(χ2=14.70，P<0.01)。

3 讨论

甲真菌病是最常见的甲病，是由各种真菌引起的甲板或甲下组织感染，最常见致病菌是皮肤癣菌，其次为酵母菌和非皮肤癣菌霉菌(nondermatophyte mould，NDM)[2]。本研究表明，皮肤癣菌是浙北地区甲真菌病的优势致病菌，且以红色毛癣菌为多见，其次为非皮肤癣菌，然后是酵母菌中的白念珠菌，这与国内各地区的调查研究得到的优势菌种结果类似，但亦有报道部分地区病甲中的致病菌以酵母菌占首位[3，4]，其次为皮肤癣菌，霉菌相对少些，具有一定的差异。本文对334例甲真菌病例进行分析后发现，本组甲真菌病的临床特点和致病菌菌种分布与国内有着相似的地方，同时也有自身特点。本研究的病例中，男女甲真菌病的致病菌都以皮肤癣菌为主，差异无统计学意义，而王丽纳等[5]报道的却是男性以感染皮肤癣菌为主，女性感染酵母菌为主，这种差异可能与地域、气候、生活环境有关，还可能与收及患者的性别比例不同相关。在感染部位上，指甲更易受酵母菌感染(52.34%)，趾甲更易受皮肤癣菌感染(58.74%)，可能与指、趾甲接触面不同有关，这与王丽纳等[5]报道类似。而甲真菌病患者在年龄分布上主要是中青年阶段36～55岁，可能原因是中青年新陈代谢旺盛、经常参加社交活动和不良卫生习惯导致的。在性别分布上，男女患病比例为1∶1.75，女性明显多于男性，尤其是中青年女性(36～55)岁多发，这与大多数文献报道相符合。这可能与女性更注重自身仪表，患病后会更加积极就诊、更多地参与家务劳动、穿皮鞋，潮湿的环境更利于真菌生长，还有做美甲等对甲造成的物理及化学性损伤的情况增加等因素有关[6]。小孢子菌属很少感染甲，国内外均有少数小孢子菌属菌种感染甲板的文献报道[7]，而本研究没有培养出小孢子菌，可能和地域，气候和生活环境有关。短帚霉是英国最常见的霉菌感染源。柱顶孢霉也可从热带地区患者的病甲中分离出。其他引起甲感染的霉菌包括曲霉属、枝顶孢霉、镰刀菌属等，而本研究只培养出了曲霉和青霉两种非皮肤癣菌，这同样可能和地域，气候和生活环境有关

近年来随着糖尿病及器官移植等疾病患者逐渐增多，甲真菌病在免疫功能低下及糖尿病等基础疾病患者中的感染率也升高，应结合患者的临床表现、一般情况等，注意甲真菌病的鉴别诊断，如甲营养不良及银屑病甲病、慢性湿疹甲改变等继发性甲损害疾病[8]。酵母菌在甲真菌病主要致病菌中的比例升高亦可能与此有关[9，10]。本次调查值得注意的是甲真菌病培养时, 虽然培养基中加了放线菌酮、氯霉素等抑菌剂,但仍有多株污染真菌生长,考虑其中有部分为致病菌,因为方法学的原因,不能将其分离并鉴别出来,在今后工作中采用Tosti等提出的非皮肤癣菌甲真菌病诊断标准[11]将其进一步分离鉴定。

因为甲真菌病患者直接镜检和真菌培养的阳性率均不高，而且培养耗时较长，难以符合临床的实际需要。因此，在临床工作中，国内外很多皮肤科医生凭借经验，根据皮损的形态和镜检结果，没有等到真菌培养结果出来便开具常用药物，如特比萘芬片或伊曲康唑胶囊等。所以，详细了解浙北地区甲真菌病致病菌种的种类和分布，对本地区甲真菌病的防治具有一定的参考价值和指导意义[12]。

甲真菌病病原菌菌种分布受年龄，性别，气候，地理等重要因素的影响，处于不断变迁之中。因此，坚持开展甲真菌病病原菌的流行病学监测，对甲真菌病的治疗和预防都有积极意义。

[1] 董兴军.KOH和乳酸酚棉蓝染色法在浅部真菌病直接镜检中的应用比较[J].中国真菌学杂志，2014,9(3)：170-171.

[2] 纪青，向耘.珠海市甲真菌病的流行病学研究[J].中国民族民间医药，2015，4:106-107.

[3] 吴绍熙，刘维达，郭宁如，等.2002-2003年中国部分地区甲真菌病致病菌流行病学调查报告[J].临床皮肤科杂志,2005,34(9):632-633.

[4] 尹颂超，张云青，谭永芳，等.805例甲真菌病真菌培养结果分析[J].中国真菌学杂志，2013，8(4):214-216.

[5] 王丽纳，朱焱，庄永灿,等.福建省泉州地区428例甲真菌病的致病菌分析[J].皮肤性病诊疗学杂志，2017，24(3)：184-187.

[6] 吴玲剑，裘晓乐，陈彬，等.浙江省温州地区甲真菌病临床及病原菌分析[J].现代实用医学，2013，25(11):1287-1288.

[7] de Hoog GS，Guarro J，Gené J,et al.Atlas of clinical fungi: The ultimate benchtool for diagnosticsversion[M].version4.0 2014.

[8] 林松发，黄云丽，程露,等.2011-2014年昆明地区甲真菌病回顾性调查分析[J].皮肤病与性病，2015，37(5)：281-282.

[9] 朱敬先，郝宏艺，李力翠，等.对石家庄地区106例甲真菌病的病原学及临床资料分析[J].中国真菌学杂志，2012,7(6):352-355.

[10] 汤勇军，莫惠芳，钟卫红，等.佛山市禅城区糖尿病病人甲真菌病流行病学调查[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2010，9(3):155-157.

[11] 牛云彤.甲真菌病的诊断[J].中国麻风皮肤病杂志,2004,20(1):57-58.

[12] 蔡剑峰，张学奇，李智铭，等.甲真菌病的菌种鉴定及药敏分析[J].温州医学院学报，2013，43(1):45-46.