AP1S3基因突变与泛发性脓疱型银屑病的相关性研究

李璐璐 尤家宝 付希安 于功奇 刘 红 张福仁

泛发性脓疱型银屑病(generalized pustular psoriasis, GPP)是一种病因不明、危及生命的系统性炎症性皮肤病。该病常表现为突然、反复发作的高热、泛发性皮疹及播散性无菌性脓疱，常伴有白细胞和 C反应蛋白升高，严重者可累及内脏器官，甚至危及生命[1]。该病的病因和发病机制尚未完全明确，研究已经证实遗传因素在疾病的发生、发展中发挥重要作用[2]。 2011 年， Marrakchi等[3]最先采用纯合子定位与直接测序法发现9个GPP家族均携带同一IL36RN 纯合子错义突变，此突变导致 IL36Rα 结构和功能变异从而发生 GPP，使得 GPP 的遗传研究取得了突破性的进展。2012年，Jordan等[4]首次报道1例欧洲散发GPP患儿的CARD14基因c.413A>C(p.Glu138Ala)突变。我们团队在2014年也对62例GPP进行了IL36RN基因检测，发现了2个新的突变位点，这些病例的CADR14基因测序，发现了4个新的突变位点。2个基因在GPP患者群体的突变率分别为46.77%(基因IL36RN)，4.8%(基因CARD14)，显示GPP的发病具有遗传异质性[5,6]。最近， Setta-Kaffetzi等[7]首次报道了欧洲脓疱型银屑病人群中AP1S3基因2个有害的少见突变位点，分别为c.11T>G(p.Phe4Cys)、c.97C>T(p.Arg33Trp)，该发现尚未在其他种群中得到验证。因此为系统阐释GPP的遗传发病机制，探讨AP1S3基因是否与中国汉族种群GPP相关，我们收集了2014-2017年在我院住院的107例GPP，对其进行了AP1S3基因测序，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象根据GPP的诊断标准[8]，将2014年1月至2017年2月山东省皮肤病医院住院患者中确诊为GPP的107例纳入研究，所有患者病史资料完整。患者皆为中国汉族。其中男60例，女47例，男∶女=1.3∶1。年龄5～76 (35.44±18.02)岁，发病年龄(31.47±18.55)岁，男性患者年龄(33.93±18.73)岁，女性患者年龄(37.06±17.19)岁，二者比较差异无统计学意义(P=0.332)。我们的研究根据是否合并寻常型银屑病(psoriasis vulgaris，PV)症状,将所有GPP患者分为不合并PV症状的GPP(GPP alone)和合并PV症状的GPP(GPP with PV)；根据GPP的发病年龄分为儿童型泛发性脓疱型银屑病(pediatric-onset GPP, PGPP)和成人型泛发性脓疱型银屑病(adult-onset GPP, AGPP)。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA制备 本研究获得山东省皮肤病医院伦理委员会批准，在获得知情同意的前提下，抽取107例GPP患者外周静脉血5 mL,乙二胺四乙酸二钾(EDTAK2)抗凝，用TGuide大体积血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周全血DNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行。提取后的DNA用全波长紫外/可见光扫描分光光度计ND-8000(NanoDrop公司)测定其纯度及含量，要求A260/A280>1.8，根据DNA原液浓度将DNA原液标化为30 ng/μL的DNA模板至96孔板内。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 拟扩增AP1S3基因(参考号NR_110905.1)的1、2、3、4、5五个外显子的引物设计序列见表1[7]，由北京华大基因研究中心合成。PCR反应在便携式PCR扩增试剂盒(2×Taq PCR MasterMix)中进行。反应体系12.5 μL:Taq Mix(为dNTP、Taq酶和缓冲液的混合物)6.5 μL,灭活的去离子水ddH2O 5 μL,引物(F+R)0.5 μL，模板DNA 0.7μL。反应条件：95℃预变性10 min,进行以下35个循环:95℃变性40 s,退火(退火温度见表1)，72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min。12 g/L琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。GelRed染色摄片。

1.2.3 DNA测序 将所有阳性扩增条带的样本采用乙醇醋酸钠纯化法纯化。分离纯化后的DNA采用双脱氧链终止法(Sanger 测序法)，在ABI 3500XL DNA测序分析仪(美国Applied Biosystem 公司)上进行基因测序。测序结果与NCBI下载的参考序列同时输入NCBI Nucleotide BLAST中进行比对分析。测序引物采用各外显子的上游引物。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，采用非参数检验、t检验、χ2检验等方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 PCR扩增AP1S3基因外显子引物序列和退火温度及产物片段

2 结果

2.1 临床资料 107例GPP患者中包括无PV症状的GPP 31例，男13例，女18例，年龄(31.19±21)岁，发病年龄(23.32±20.43)岁；合并PV症状的GPP 76例，男46例，女30例，年龄(36.99±16.57)岁，发病年龄(34.79±16.87)岁。无PV症状的GPP及合并PV症状的GPP性别构成比差异无统计学意义(χ2=0.028，P=0.876)，GPP alone及GPP with PV发病年龄差异有统计学意义(Z=1.773,P=0.004)。PGPP 31例，男20例，女11例，年龄(15.06±8.77)岁；AGPP 76例，男28例，女36例，年龄(43.57±13.84)岁。PGPP及AGPP性别构成比差异无统计学意义(χ2=3.603，P=0.058)，见表2。

表2 107例GPP患者的基本临床资料

2.2 AP1S3测序结果 107例GPP患者AP1S3基因所有外显子进行PCR扩增，扩增片段与所设计的片段大小一致，无非特异性扩增带。其产物经测序比对后发现，107例GPP患者AP1S3基因5个外显子中均未发现任何少见突变、低频突变及SNP位点。

3 讨论

GPP是一种少见的危及生命的系统性炎症性疾病，临床以突然发生并反复出现的红斑基础上粟粒大的无菌性脓疱为特点，可泛发全身，并伴有高热及全身不适。1910年，Zumbusch首次对该病进行了描述。统计显示GPP在欧洲及日本国家的发病率为0.6/100万～0.7/100万，但中国仅有病例报道，尚无相关数据[9]。在临床上，根据有无寻常型银屑病(psoriasis vulgaris, PV)症状，GPP分为单纯性GPP(GPP without PV, GPP alone)及伴随PV症状的GPP(GPP with preceding, later or accompanied by PV, GPP with PV)。根据GPP的发病年龄，18周岁之前发病的患者归为儿童型GPP(pediatric-onset GPP, PGPP)，18周岁之后发病的患者归为成人型GPP(adult-onset GPP, AGPP)[2]。我们的研究包括107例中国GPP患者，其中包括31例无PV症状的GPP(GPP alone)及76例伴随PV症状的GPP患者(GPP with PV)，包括31例PGPP及76例AGPP，不同组别之间性别构成比无差异；少数的无PV症状的GPP(GPP alone)患者的发病年龄明显低于大多数的伴随PV症状的GPP(GPP with PV)患者，与之前的研究结果[10]相符,提示无PV症状的GPP可能是GPP的独特亚型，不同于伴随PV症状的GPP。

GPP的病因和发病机制尚未完全明确，研究已经证实患者的遗传因素在疾病的发生中发挥重要作用[2]，IL36RN、CARD14基因先后在欧洲种群与中国种群中被证实与GPP发病相关，只有少部分GPP患者携带IL36RN或CARD14基因突变，提示该病具有遗传异质性。最近在2014年，Setta-Kaffetzi等[7]通过对7例Hallopeau连续性肢端皮炎进行外显子测序，发现AP1S3基因突变，同时他们对256例脓疱型银屑病(包括72例亚洲GPP患者)进行了直接测序验证，发现AP1S3基因2个有害的少见突变，分别为c.11T>G(p.Phe4Cys)、c.97C>T(p.Arg33Trp)，基因突变频率达到5.9%，与3388例正常对照的突变率1.4%相比，差异具有统计学意义(P=2.5×10-7)，但在72例亚洲患者中亦未发现任何突变。随后，Capon团队[11-13]对99例亚洲GPP患者(绝大多数为马来西亚人，具体不详)AP1S3基因进行了直接测序，未发现突变。2017年Mössner等[14]研究发现32 864例非法国籍欧洲正常对照AP1S3基因的少见突变等位基因频率2.3%与51例欧洲GPP患者AP1S3基因的少见突变等位基因频率2.0%相比无差异。因此对于GPP与AP1S3基因相关性的认识存在诸多争议。AP1S3基因编码AP-1蛋白的σ1亚单位的一种异构体σ1C，Sugiura等[11]通过构建三维蛋白模型发现报道的两处突变可严重破坏AP1的稳定性，作者发现敲除AP1S3基因的HaCaT细胞，转运至内吞体的先天性模式识别受体Toll样受体3 (TLR-3)明显减少，导致TLR-3介导信号通路中IFN-β表达显著下降。IFN-β不仅本身具有抗炎功能还能下调抗炎因子IL-1的表达，从而抑制皮肤炎症的发生。因此AP1S3基因缺陷干扰TLR-3在细胞质内的转运，进而抑制其下游IFN-β表达下降，IL-1及IL36Tα细胞因子表达上调，导致皮肤炎症的发生。本研究中我们对107例中国汉族GPP患者AP1S3基因进行了Sanger直接测序，亦未发现任何少见突变、低频突变及SNP位点，结合既往研究推测AP1S3基因可能与亚洲GPP患者疾病的发生并无相关性。

我们的研究提供了中国人群GPP患者AP1S3基因测序的结果，但未发现AP1S3基因突变与中国人群GPP的发病相关。结合 Setta-Kaffetzi等[7]、Mahil等[13]及Mössner等[14]的研究结果，AP1S3基因突变导致TLR-3稳态失衡，进而导致细胞质囊泡转运障碍从而发生脓疱性皮肤病，但其在各族人群中的发病率及其相关的疾病谱仍需大量的样本数据支持。脓疱型银屑病作为一种多基因遗传疾病，其遗传模式尚不确定，仍需要开展深入的遗传学研究，以便为进一步遗传咨询、产前诊断和靶向治疗药物研发奠定基础。

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