几丁质酶对香菇多糖提取的影响

李俊峰，张扬扬，李 明

（通化师范学院食品科学与工程学院，吉林通化 134001）

香菇为担子菌亚门，担子菌纲，伞菌目，侧耳科。香菇属真菌，因其口味鲜美、香味浓郁、营养丰富，有显著的药用及滋补作用而被誉为“蘑菇皇后”“抗癌新兵”“菌中之秀”[1]。香菇多糖是从香菇中分离出的一种高纯度、高分子结构的葡聚糖[2]，在免疫调节[3]、抗肿瘤[4]、抗病毒和抗感染等方面有很强的活性，其疗效高、毒副作用小，具有很高的研究和开发价值。因此，香菇多糖被广泛应用于食品工业、发酵工业、医疗保健等领域[5-6]。目前，多糖的提取方法主要有热水浸提法、超声波提取法、稀酸稀碱浸提法、微波提取法、酶解法等几种方法[7]。传统的浸提法时间长、得率低、能耗大，为克服传统提取方法的缺点，许多学者研究了亚临界水提取法[8]，超临界二氧化碳萃取技术与热水浸提法[9-10]，超滤膜技术提取法[11]、纤维素酶协同超声波法[12]、响应面法优化热水浸提法[13]等。

研究显示，在香菇等真菌类食品原料中，活性多糖主要存在于由纤维素和几丁质构成的细胞壁中[14]。为了提取活性多糖，首先必须破坏纤维素和几丁质在细胞壁中构成的网络结构，从而将活性多糖释放出来，才能充分并有效地提取活性多糖。但是，在现有的酶法提取香菇多糖的试验中，主要研究纤维素酶、果胶酶和蛋白酶对香菇多糖提取的影响，而几丁质酶在香菇多糖的提取研究中还没有报道，而几丁质酶的存在可能会阻碍一部分活性多糖的释放，导致活性多糖不能被充分提取。

试验首次采用几丁质酶辅助提取香菇多糖，并与纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶进行对比，从而考查几丁质酶对酶法提取香菇多糖得率的影响。研究结果对补充香菇多糖提取的研究内容、促进香菇多糖的开发与应用具一定的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

干香菇（市售）；苯酚、浓硫酸、无水乙醇、葡萄糖等试剂均为分析纯；几丁质酶（活力≥200 U/g）、纤维素酶（活力≥400 U/mg）、果胶酶（活力≥50 U/g）、木瓜蛋白酶（活力≥800 U/mg），上海一基实业有限公司提供。

1.2 仪器与设备

FW-200型高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司产品；SY200型振动筛，新乡市特昌振动机械有限公司产品；TDL-40B型离心机，上海安婷科学仪器厂产品；RE-2000型旋转蒸发仪，郑州市煜城仪器有限公司产品；722S型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 香菇多糖的提取

（1）工艺流程。粉碎→过筛→称量→提取→抽滤→旋转蒸发→醇沉→离心→多糖。

（2） 香菇多糖的提取。将干香菇粉碎过80目筛，称取一定量香菇干粉，回流提取，将提取液进行抽滤，浓缩至1/3左右，用4倍体积的95%乙醇浸提12 h，离心后得到香菇多糖。1.3.2 热水浸提法单因素试验

（1）不同料液比对香菇多糖得率的影响。固定提取温度55℃，提取时间2 h，物料粒度80目，考查料液比为 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35时，对香菇多糖得率的影响。

（2）不同提取温度对香菇多糖得率的影响。固定料液比1∶25，提取时间2 h，物料粒度80目，考查温度为55，75，85，95，105℃时，对香菇多糖得率的影响。

（3）不同提取时间对香菇多糖得率的影响。固定料液比1∶25，提取温度55℃，物料粒度80目，考查提取时间为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h时，对香菇多糖得率的影响。

（4）不同物料粒度对香菇多糖得率的影响。固定料液比1∶25，提取温度55℃，提取时间2 h，考查物料粒度为40，60，80，100，120目时，对香菇多糖得率的影响。

1.3.3 正交试验设计

选取料液比、提取时间、提取温度、原料粒度4个因素，进行四因素三水平正交试验，每组试验做3次平行。基于单因素试验结果，选择料液比分别为1∶25，1∶30，1∶35；提取时间分别为 1.5，2.0，2.5 h；粒度60，80，100目；提取温度分别为75，85，105℃进行正交试验。

正交试验设计见表1。

1.3.4 酶法辅助提取香菇多糖

将干香菇粉碎过80目筛，称取5.00 g香菇干粉，加入125 mL蒸馏水中，加入酶制剂，在一定条件下酶解，酶解后于85℃条件下提取2 h，将提取液进行抽滤，在浓缩至1/3左右，用4倍体积的95%乙醇浸提12 h，离心后得到香菇多糖。

表1 正交试验设计

1.3.5 检测方法

利用苯酚硫酸法[15]测定提取物中多糖含量，先制作葡萄糖标准曲线，然后在相同条件下测定样品吸光度，通过代入标准曲线换算出样品得率。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的制作

以葡萄糖质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示。标准曲线方程为Y=1.528 9X+0.054 4，R2=0.979 6。

葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 不同料液比对香菇多糖得率的影响

不同料液比对香菇多糖得率的影响见图2。

图2 不同料液比对香菇多糖得率的影响

由图2可知，提取过程中，料液比为1∶15～1∶25时，香菇多糖得率逐渐增高，可能是因为随着液料比的增加，提高了多糖从物料颗粒内部向溶剂扩散的传质效率，从而使多糖得率不断上升。当料液比在1∶25～1∶35时，得率的上升具有渐渐放缓的趋势。根据试验所得结果，同时考虑提取成本，选择为1∶25为最佳提取料液比。

2.2.2 不同提取温度对香菇多糖得率的影响

不同提取温度对香菇多糖得率的影响见图3。

图3 不同提取温度对香菇多糖得率的影响

由图3可知，当提取温度为55～105℃时香菇多糖得率逐渐增高，之后放缓。当提取温度为105℃时达到最大值。这可能是由于温度的上升提高了多糖在水中的溶解度，从而提高了多糖的得率。但是，当提取温度高于85℃时，多糖得率的上升并不显著。因此，为了不增加提取过程的能耗，确定提取温度为85℃。

2.2.3 不同提取时间对香菇多糖得率的影响

不同提取时间对香菇多糖得率的影响见图4。

由图4可知，当提取时间在1～2 h时，随提取时间的增加，香菇多糖得率也随之增高。当提取时间为2 h时，香菇得率最高。当提取时间在2～3 h时，随提取时间的增加，香菇多糖得率降低。这可能是因为提取时间过长，香菇中的其他水溶性成分溶出增加，抑制了香菇多糖的溶出。因此，根据试验结果确定提取时间为2 h。

2.2.4 不同物料粒度对香菇多糖得率的影响

不同物料粒度对香菇多糖得率的影响见图5。

由图5可知，粒度为40～80目时，香菇多糖得率随物料粒度的增加而上升，当物料粒度为80目时，香菇多糖得率最高。当物料粒度在80～100目时，随物料粒度的增加，香菇多糖得率不断降低。这可能是因为粒度过低，在粉碎过程中破坏了香菇多糖的结构，导致多糖得率降低。因此，根据试验结果确定物料粒度为80目。

2.3 正交试验结果与分析

根据正交试验设计表，选取料液比、提取时间、提取温度、原料粒度4个因素，进行四因素三水平正交试验。

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

由表2可知，对香菇多糖得率影响因素由大到小为提取时间＞料液比＞物料粒度＞提取温度。水平2的香菇得率最高，试验结果最好，试验水平组合为A1B2C2D2，而由K值可知，试验最佳组合为A3B2C2D2。验证试验结果为1.678%，得率高于A1B3C2D2。由正交试验可得，香菇多糖最佳提取工艺参数为料液比1∶35，提取温度105℃，提取时间2 h，物料粒度80目，香菇多糖得率为1.678%。

2.4 酶对香菇多糖得率的影响

为了得出几丁质酶对香菇多糖的影响，试验中将几丁质酶与木瓜蛋白酶、果胶酶、纤维素酶的酶法辅助提取结果进行了比较。

不同酶法辅助提取香菇多糖的结果见表3。

表3 不同酶法辅助提取香菇多糖的结果

通过查阅酶法提取香菇多糖的研究文献，归纳得出木瓜蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的最佳酶解条件为酶解温度40℃左右，酶解pH值5左右，酶使用量0.5%左右。因此，为了将不同酶的提取结果进行比较，试验中将4种酶的酶解条件保持一致。

由表3可知，酶法辅助提取香菇多糖的得率都高于水提法，且几丁质酶辅助提取法的得率最高。这一结论说明，为了充分提取存在于香菇细胞壁中的活性多糖，必须破坏纤维素和几丁质在细胞壁中构成的网络结构，仅破坏纤维素、蛋白质和果胶还不足以充分提高多糖的得率。因此，研究结果证明，几丁质酶在提高香菇多糖的得率方面具有显著作用。

3 结论

通过单因素试验和正交试验，考查了不同料液比、提取温度、原料粒度和提取时间对香菇得率的影响，从而得出热水提香菇多糖最佳提取工艺参数为料液比1∶35，提取温度105℃，提取时间2 h，物料粒度80目，香菇多糖得率为1.678%。酶法提取试验得出，木瓜蛋白酶提取香菇多糖得率为1.916%，果胶酶提取香菇多糖得率1.926%，纤维素酶提取香菇多糖得率1.684%，几丁质酶提取香菇多糖得率2.05%。研究结果可以证明，几丁质酶对香菇多糖的提取具有显著的影响。

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