辣椒炭疽病病原菌生物学特性及其拮抗菌防效研究

李国光，田瑞华，赵 磊，周才芯，林瑞雄

（内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）

位于呼和浩特市南部的托克托县地处黄河中上游分界线拐弯处，是有名的辣椒种植区。当地所产的“灯笼红”辣椒具有色泽鲜艳、皮厚肉多、含水量低、糖分和含油量高等特点，富有“香而微辣”的美誉，也是农民经济收入的主要作物之一。但是，随着当地辣椒种植面积的扩大，农耕用地面积的有限性，作物轮作存在困难，导致辣椒病害产生且逐渐扩大，严重影响了辣椒的产量和农民的增收。去年，由于辣椒病害，当地辣椒产量仅仅是往年的一半，给农民带来严重经济损失。

据调查，托克托县地区的辣椒病害是炭疽病，在高温多雨的7月下旬最容易发病，具有传播速度快、致病性强的特点。致病菌主要作用于辣椒果实，叶片也会染病，但不及果实严重。健康辣椒果实染病后，其病斑呈黄褐色，类似于水渍状，中心有密布的红色小点，并且呈同心圆状，逐渐致使果实腐烂[1]。据报道，各地辣椒炭疽病致病的病原菌有一定的差异，主要有辣椒丛刺盘孢菌（Vermicularia capsici Syd）、辣椒盘长孢菌（G.piperatum Ell.et EV）、胶孢炭疽菌 （Colletotrichum gloeosporioides） 等[2-3]。目前对辣椒炭疽病的防治主要是以化学防治为主，据当地农民反映，病害出现初期，喷施化学药物有一定的防治作用，但是效果有限，不能持续。因此，对当地农民来说，迫切需要一种高效、无害的防治辣椒炭疽病的方法。试验基于当地辣椒炭疽病害的发病特征，对致病菌的生物特性进行研究，以筛选高效拮抗菌为目的，为建立托克托县辣椒炭疽病的生物防治寻求新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

供试拮抗菌，拮抗菌从呼和浩特市周边田地土壤中分离纯化后所得，保藏于4℃冰箱中备用；供试辣椒，来自呼和浩特市托克托县农户辣椒种植区，分别采集具有典型症状的炭疽病发病果实和健康果实，保藏于自封袋中，用于病原菌分离和致病性检测；培养基，病原菌和拮抗菌的分离纯化及培养均采用PDA培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分离纯化

采用植物组织分离法[4]，将辣椒炭疽病发病果实用无菌水冲洗3次，去除表面泥渍并晾干，用75%的酒精进行表面消毒30 s，再用0.1%的氯化汞将辣椒表面消毒30 s，然后用无菌水冲洗3次。在无菌条件下，在果实病斑边缘处切取约3 mm×3 mm的组织块并置于PDA平板上，放于28℃恒温培养箱中培养3～4 d。每天观察培养皿中各菌落的生长状况，当组织块边缘长出菌丝后及时挑取，并转接于PDA培养基中，重复上述过程，直至长出单菌落为止。纯化后的病原菌保藏于4℃冰箱中备用。

1.2.2 病原菌致病性检测及其鉴定

辣椒炭疽病致病性检测依照柯赫准则[5]。将病原菌活化后用无菌水制成菌悬液，在无菌条件下用接种针沾取少量病原菌菌悬液，刺入经过消毒的新鲜健康辣椒果实和叶片组织深约1 mm，然后在其表面轻刮使其出现伤口，对照组用无菌水接种，每组设3个重复。接种后，置于28℃的恒温培养箱中保湿培养，观察发病情况。

将活化后的病原菌在PDA培养基中培养5 d，观察菌落特征，并在显微镜下观察菌丝及孢子的形态学特征，参照《真菌鉴定手册》及rDNA-ITS序列分析[6]进行鉴定。

1.2.3 培养条件对病原菌生长的影响

（1）温度对病原菌菌丝生长的影响。无菌条件下用打孔器从活化后的病原菌边缘打取直径为4 mm的菌饼，转移到PDA培养基平板的中央，分别置于温度为 5，10，15，20，25，30，35，40 ℃条件下进行连续培养，每隔1 d观察菌丝生长状况，并用游标卡尺以十字交叉法测量各菌落的直径，每个处理设 3个重复。

（2）pH值对病原菌菌丝生长的影响。将直径为4 mm的病原菌菌饼分别置于pH值为3，4，5，6，7，8，9，10的PDA平板培养基中，于28℃条件下恒温培养，5 d后采用十字交叉法测量各菌落的直径，每个处理设3个重复。

（3）光照对病原菌菌丝生长的影响。将直径为4 mm的病原菌菌饼接种于PDA培养基中央，分别置于完全光照、光暗交替（每12 h）、完全黑暗3种光照条件下，于28℃条件下恒温培养3 d后，测量菌落直径，每个处理设3个重复。

（4）培养基对病原菌菌丝生长影响。将直径为4 mm的病原菌菌饼接种于PDA培养基、水琼脂培养基、高氏1号培养基、玉米粉培养基和查氏培养基，置于28℃条件下恒温培养5 d后，测量菌落直径，每个处理设3个重复。

1.2.4 拮抗菌及其发酵液对病原菌的抑制作用

（1）拮抗菌的抑菌作用。采用平板对峙培养法[7]，用打孔器从病原菌边缘打取直径为4 mm的菌饼，转移到PDA培养基平板的中央，然后在距病原菌菌饼5 mm处以十字交叉的方式各放置拮抗菌菌饼于十字的四端，置于28℃恒温培养箱中培养，以病原菌作对照组，观察抑菌效果，设3个重复。

（2） 拮抗菌发酵液的抑菌作用。将拮抗菌于PDA液体培养基中进行摇瓶恒温培养，5 d后，将发酵液过滤灭菌，在无菌条件下取5 mL加入到未凝固的PDA平板中轻轻摇匀，待其凝固后接种病原菌菌饼，置于28℃恒温培养箱中培养，以同等量的无菌水作为空白对照，设3个重复，每天测定菌落直径并计算抑菌率[8]。

1.2.5 拮抗菌对致病辣椒果实的防效试验

采取托县辣椒种植区新鲜的辣椒果实，经消毒后，分别设置A，B，C 3个处理，A处理用接种针接种病原菌进行感染；B处理接种病原菌后，于病斑出现时喷施1次拮抗菌发酵液；C处理只接种拮抗菌发酵液。各处理组设3个重复，置于28℃条件下保湿恒温培养7 d后，观察辣椒果实炭疽病发生情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌致病性检测及鉴定结果

从辣椒病斑边缘分离纯化后的单菌落菌悬液经科赫法则进行致病性检验发现，辣椒果实及植株叶片均会被感染，并出现黑斑，而对照组不受感染。果实上的病斑为近圆形或不规则形，病斑中部呈灰褐色，在其表面有稍微突起的同心圆纹，上面有小点附着，密布的小点主要为黑色，在湿度大的条件下，病斑表面有时会析出红色物质。叶片的病斑初期为水浸状浅绿色斑点，后期形状接近圆形，并且逐渐变为褐色，中间为淡灰色，这与种植区辣椒病株的症状相似。将果实和叶片病斑处的组织按照上述方法进行组织分离，得到的病原菌与试验病原菌形态一致，故可确定该病原菌就是托克托县辣椒种植区炭疽病病原菌。

病原菌复染辣椒果实和叶片见图1，病原菌形态特征见图2。

图1 病原菌复染辣椒果实和叶片

图2 病原菌形态特征

病原菌在PDA培养基菌落形态如图2所示，菌丝生长速度较快，培养5 d后长满培养皿，菌落呈圆形，中心有凸起，菌丝呈白色棉絮状，气生菌丝很发达。菌落在培养初期呈白色，后期在菌落中央出现粉红色同心轮纹。在显微镜下观察菌体形态特征显示，病原菌菌丝有隔，具分枝，顶端有孢子囊，分生孢子梗及分生孢子无色，呈棒状，两端椭圆形，直径15～25 um。依照《真菌鉴定手册》和病原菌rDNA－ITS序列分析，确定托克托县辣椒种植区炭疽病病原菌属胶孢炭疽菌。

2.2 培养条件对病原菌菌丝生长的影响

2.2.1 温度对病原菌菌丝生长的影响

温度对病原菌菌丝生长的影响见图3。

图3 温度对病原菌菌丝生长的影响

温度对病原菌菌丝生长具有很大影响，由图3可知，该病原菌菌在5～40℃下均可生长，且具有明显的规律性，随着培养温度的升高，菌落直径表现出先促进后抑制的趋势，但各温度下的长势差异较大。在25～30℃菌丝生长较快，且30℃下长势最好，其次是在25℃，预测该病原菌的最适生长温度为25～30℃。35℃下菌丝生长受到明显抑制，说明该病原菌对高温相对敏感。温度低于5℃或高于40℃菌丝生长极其缓慢，甚至停止。

2.2.2 pH值对病原菌菌丝生长的影响

pH值对病原菌菌丝生长的影响见图4。

图4 pH值对病原菌菌丝生长的影响

pH值对该病原菌菌丝生长具有明显规律性，由图4可知，病原菌在pH值4～10时均可生长，最适pH值在7左右。pH值6～9范围内菌丝生长较好，且菌丝致密、边缘整齐，可见病原菌适宜在中性偏碱的环境中生长；pH值小于5和高于9菌丝生长均受到不同程度的抑制，菌丝比较稀疏，边缘不规则。

2.2.3 光照对病原菌菌丝生长的影响

光照对病原菌菌丝生长的影响见图5。

图5 光照对病原菌菌丝生长的影响

光照对病原菌菌丝生长有一定影响，由图5可知，光暗交替下更有利于病原菌的生长，完全光照和完全黑暗的条件下，病原菌虽也能生长，但长势不如光暗交替处理组。而完全光照和完全黑暗条件下菌丝生长差异不是很明显，光照组比黑暗组长势稍好，这与宋婷等人[9]的研究结果一致。

2.2.4 培养基对病原菌菌丝生长的影响

培养基对病原菌菌丝生长的影响见图6，不同培养基下的菌落形态见表1。

图6 培养基对病原菌菌丝生长的影响

病原菌在不同的培养基上生长状况有很大差异（见图6）。从菌落直径来看，CZ培养基最适合该菌生长，其次是PDA培养基，二者差异不大。在高氏1号和玉米淀粉培养基中，菌落直径不及前二者，而在水琼脂培养基中，菌丝几乎不生长。从菌落形态来看（见表1），PDA培养基下的菌丝交联致密，气生菌丝发达，并出现粉色轮纹，而其他培养基菌丝交联疏松，气生菌丝不发达，长势不佳。综合来看，PDA培养基最适合病原菌生长。

表1 不同培养基下的菌落形态

2.3 拮抗菌及其发酵液对病原菌的抑制作用

拮抗菌对病原菌菌丝的抑制效果见图7，拮抗菌发酵液对病原菌菌丝的抑制效果见图8，拮抗菌发酵液对病原菌菌丝的抑菌率见表2。

图7 拮抗菌对病原菌菌丝的抑制效果

图8 拮抗菌发酵液对病原菌菌丝的抑制效果

表2 拮抗菌发酵液对病原菌菌丝的抑菌率

平板对峙试验结果表明，拮抗菌对病原菌具有明显的拮抗作用（见图7），在病原菌的4个点上均产生了清晰的抑菌圈，而且在菌落边缘和抑菌圈接触部位的菌丝生长缓慢，受到抑制。对照组的菌落平铺于平板中央，并呈圆形扩展。说明拮抗菌对病原菌菌丝的生长具有一定的抑制作用。

由图8可知，在经过滤灭菌的拮抗菌发酵液制成的平板上，病原菌菌丝生长也受到明显的抑制作用。对照组菌丝平铺于整个平板，且有粉红色轮纹，而试验组菌丝虽交联致密，但生长仅局限在一定的范围，且没有出现粉红色轮纹。这表明，拮抗菌的抑菌作用并不是与病原菌竞争营养物质产生的，而是拮抗菌能够分泌某种物质，这种物质抑制了病原菌的生长。

由表2可知，随着培养时间的延长，拮抗菌的拮抗作用持续存在，5 d后抑菌率达60.33%。

2.4 拮抗菌发酵液对致病果实的防效试验

拮抗菌发酵液的防治效果见图9。

图9 拮抗菌发酵液的防治效果

辣椒果实3个处理经保温保湿培养7 d后，结果如图9所示，A，B处理经病原菌感染后，在第3天时均出现了约5 mm的病斑，对B处理病斑处喷施一定量的经过过滤灭菌的拮抗菌发酵液，培养7 d后，B处理果实病斑明显小于A处理果实的病斑，而C处理的果实没有出现病斑，这说明拮抗菌的发酵液对辣椒炭疽病病原菌有很明显的抑制作用，且对健康果实无害，这对拮抗菌的后期田间试验尤为重要。

3 结语

通过构建生防菌来防治辣椒病害的研究越来越多[10-11]，生物防治有高效、低毒、低残留、对天敌不构成威胁等特点[12]，同时此方法成本低、兼防兼治、增产增收，是一种最有效防治病害的方法[13]。托克托县地区辣椒炭疽病的爆发与当地农业生产习惯有很大关系，由于辣椒可给农户带来可观的经济收入，而农民耕地有限，因此连续在同一块土地种植辣椒，土地缺乏合理轮作换茬，致使土地传病害蔓延[14]。同时，气候条件也是引起当地辣椒炭疽病害原因之一，据农户反映，连续阴雨天加上持续高温会导致炭疽病的发生。研究表明，呼和浩特市托克托县辣椒种植区的炭疽病是由胶孢炭疽菌引起的，该病菌在5～30℃均可生长，在25～30℃下最有利于菌丝生长，这与唐景美等人[15]的研究结果基本相同，也符合托克托县地区7月下旬辣椒炭疽病发病的气候特征；病原菌对pH值不敏感，在pH值4～10时均可生长，但喜欢弱碱性环境；光照和黑暗环境都可以影响致病菌菌丝的生长，但是光暗交替更有利于菌丝生长，这与宋婷等人[9]在花椒炭疽病研究的结果一致；致病菌对营养条件要求不高，最适生长培养基为PDA，在水琼脂培养基上停止生长；分离所得拮抗菌对病原菌菌丝生长有明显的抑制作用，这种抑制作用并不是拮抗菌与病原菌互相竞争营养物质的结果，而是拮抗菌通过分泌抑菌物质来实现的；拮抗菌的发酵液对致病辣椒果实也有很好的防效，拮抗菌本身对辣椒健康果实无害，这是利用生防菌来防治托克托县辣椒种植区炭疽病病害的前提。

试验研究结果可为辣椒炭疽病的防治提供参考，但是在拮抗菌的抗菌机制、生物学特性、拮抗菌鉴定、田间防效试验等方面有待于进一步研究。

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