UPLC结合正交实验法优选正骨洗药最佳水煎工艺

董逸凡，吴婷婷，张 蕊，许保海*

0 引言

正骨洗药是北京积水潭医院六十年代中医科主任佟阔泉主任医师(清末御医)的经验方。由川芎、乳香、白芷、赤芍、秦艽、续断、羌活、透骨草、降香、红花、没药、当归、苏木、木瓜、川牛膝、独活、威灵仙17味中药粉碎过筛后分装至滤纸袋，制成每袋20 g。具有活血消肿、散风祛湿的功效。用于跌打瘀血、筋骨诸痛、风寒湿性腰痛、关节痛等，临床疗效显著[1]。使用时取1袋水煮或开水冲泡后洗患处，每次0.5 h，药水凉后再热，反复数次，用后保存，每袋可用2 d。方中川芎活血行气，祛风止痛，为方中君药，其有效成分阿魏酸有抗炎、镇痛和抗氧化作用[2-4]，可剂量依赖性促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖，显著增加ALP的活性、OPG mRNA和OA mRNA的表达，具有骨形成促进效应[5]；羌活解表散寒，祛风除湿止痛，为方中臣药，有效成分异欧前胡素具有镇痛、抗炎抗菌[6]、促进大鼠成骨细胞增殖与分化的能力[7]。该药尚未制定最佳的煎煮标准，导致患者使用时，因为煎煮方法不同致使药液浓度不同进而影响疗效的问题一直存在。因此，探究正骨洗药最佳的煎煮方法，制定正骨洗药的煎煮标准，使其发挥更好的疗效，是一个亟待解决的重要问题。

1 材料

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，RE-52C型旋转蒸发仪(上海一科仪器有限公司)，KQ3200E型超声仪(昆山超声波仪器有限公司)，AG285型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。阿魏酸(批号：110773-201614)，异欧前胡素(批号：110827-201611)购于国家食品药品检定研究院；正骨洗药(批号：161202)；乙腈(HPLC级，默克公司)；磷酸分析纯(北京化工厂)，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 (BEH)C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～2 min,15% A；4～14 min,25%～65% A；14～16 min，65% A；16～17 min，65%～15% A；17～23 min，15% A；流速0.3 mL/min，进样量1.0 μL；检测波长异欧前胡素254 nm，阿魏酸330 nm；柱温30 ℃。

2.2 对照品溶液的配制 精确称取阿魏酸、异欧前胡素对照品适量，用适量甲醇溶解，分别定容至10 mL容量瓶中，摇匀，配制成含有阿魏酸、异欧前胡素浓度为0.193 mg/mL、0.016 mg/mL的混合对照品溶液，放入冰箱4 ℃避光保存。

2.3 正交实验设计 根据正骨洗药自身特点和预实验结果，采用L9(34)正交试验法考察煎煮时间、煎煮次数、加水量对正骨洗药中君药和臣药有效成分含量的影响。以正骨洗药中阿魏酸、异欧前胡素及汤剂浸出物得率为指标，其因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表

2.4 供试品溶液的制备 取正骨洗药1袋，根据正交实验表所列条件进行煎煮制成汤剂溶液。精密移取汤剂样品溶液100 mL，置于旋转蒸发仪蒸去水溶液，所得残渣加入80%甲醇，超声提取30 min，提取液4 000 r/min离心10 min，取上清液，80%甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

2.5 各指标成分含量测定

2.5.1 标准曲线绘制 精密移取含有阿魏酸和异欧前胡素的混合对照品溶液，加入甲醇逐级稀释，制成含阿魏酸19.285 4、38.570 8、77.141 6、115.712 4、154.283 2、192.854 μg/mL和异欧前胡素1.632 8、3.265 6、6.531 2、9.796 8、13.062 4、16.328 μg/mL的系列标准品混合溶液，按实验条件进样1.0 μL进行测定，分别以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。见表2。

表2 线性回归方程

2.5.2 样品测定 按色谱条件测定9组供试品中阿魏酸和异欧前胡素含量，记录峰面积值，计算各指标成分含量。色谱图见图1，阿魏酸和异欧前胡素色谱峰保留时间分别为：2.486、12.281 min。正交实验结果见表3。

图1 正骨洗药UPLC色谱图

注：A.254 nm混合对照品，B.330 nm混合对照品，C.254 nm正骨洗药，D.330 nm正骨洗药，E.川芎阴性对照，F.羌活阴性对照；1.阿魏酸，2.异欧前胡素

2.5.3 精密度实验 取混合对照品溶液，按色谱条件进样，重复测定6次，计算阿魏酸、异欧前胡素峰面积的RSD(n=6)分别为0.5%、0.17%。

2.5.4 重复性实验 分别取正骨洗药6份，按“2.4”项下方法各制备6份供试品溶液，按色谱条件进样，阿魏酸平均含量为1.54 mg/g，RSD为1.31%(n=6)；异欧前胡素平均含量为0.124 mg/g，RSD为0.28%(n=6)。

2.5.5 加样回收率实验 取已知浓度的正骨洗药，在高、中、低每个添加水平下，平行制备样品3份并测定，阿魏酸、异欧前胡素的平均回收率分别为95.90%、97.10%，RSD分别为1.11%、1.61%。

表3 正交实验结果

注：k1：“1”水平所对应的实验指标综合评分之和；k2：“2”水平所对应的实验指标综合评分和；k3：“3”水平所对应的实验指标综合评分和；R：极差

2.5.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h进样，结果阿魏酸、异欧前胡素峰面积的RSD值分别为0.48%、0.34%。

2.6 最佳结果分析 采用综合加权评分法，分别将阿魏酸、异欧前胡素、浸膏得率的权重系数设为0.3、0.2、0.5，3项中最好的指标为100分，各个指标的计分标准如下：综合评分=Y1/1.58×0.3×100+Y2/0.126×0.2×100+Y3/33.85×0.5×100。

根据表3的实验结果，利用SPSS 17.0统计软件进行F检验，见表4。从表3的极差结果看出，影响正骨洗药汤剂质量的各因素的主次顺序为C>A>B。由表4可知，因素A和C对实验结果有显著影响(P<0.05)，因素B对实验结果无显著影响(P>0.05)。经过综合分析，正骨洗药的最佳水煎工艺为A2B1C2，即煎煮30 min，煎煮1次，加20倍水。

表4 方差分析

2.7 最佳工艺验证实验 取3份正骨洗药，在最佳煎煮工艺的条件下重复3次实验，测得浸出物平均得率为33.04%±0.87%，汤剂中阿魏酸的质量分数为(1.54±0.02)mg/g，异欧前胡素的质量分数为(0.124±0.00)mg/g。

3 讨论

中药汤剂是中医临床最常用的剂型之一，汤剂的疗效与其煎煮方法有直接关系。正骨洗药为我院骨科常用药，为方便患者冲泡或煎煮使用，制成粉碎程度适中的药材粗粉。相比中药传统饮片，中药“煮散”具有煎出率高、节省药材、煎煮时间短等优点[8]，故正骨洗药不适于按照传统饮片煎煮经验煎煮。本实验根据正骨洗药自身特点设计正交实验因素水平，取君药、臣药有效成分和浸出物得率为考察指标，查阅相关文献[9-11]摸索实验条件，得到正骨洗药最佳水煎工艺为煎煮30 min，煎煮1次，加20倍水。该煎煮方法稳定可靠，可有效控制正骨洗药的质量。

本实验采用UPLC同时测定了正骨洗药2种有效成分，实验精密度、回收率等方法学验证各项指标均符合要求，此方法简便快捷，稳定可行，为临床上更合理地使用正骨洗药提供了实验依据。

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