耳聋基因的胚胎植入前诊断

毕青玲黄莎莎戴朴

1中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科（北京100853）

2中日友好医院耳鼻喉科（北京100029）

耳聋出生缺陷是影响我国出生人口素质的重要疾病之一。2006年第二次全国残疾人抽样调查数据显示,中国听力语言残疾者有2780万,在目前全国现有的8296万残疾人中占到34%。7岁以下聋儿80万,且每年新增3万聋儿。每1000个新生儿中，就有1-3名听力障碍患者，其中至少一半与遗传因素有关[1]。大规模流行病学调查结果显示GJB2和SLC26A4基因突变是我国最常见的致聋原因，致病比例分别占到15%、12%[2]。也就是说27%的中国耳聋人群是由GJB2和SLC26A4这两个基因突变导致。另外随着二代测序技术的广泛应用，更多罕见耳聋基因突变致聋者能够得到成功的基因诊断。针对这些高危家庭，遗传诊断与咨询、生育指导及产前诊断目前是预防耳聋患儿出生可行的方法。2005年中南大学附属湘雅医院首次报道SLC26A4基因突变耳聋产前诊断案例[3]。中国人民解放军总医院聋病分子诊断中心自2006年起主要针对GJB2、SLC26A4这两个中国人群中最常见的常染色体隐性遗传耳聋基因建立了标准化的产前诊断流程[4]。但由于耳聋是非致死性疾病，其产前诊断及可能带来的引产一直存在伦理争议，随着我国经济的发展、人民生活水平提高及思想的转变，亟需胚胎植入前诊断（preim plantation genetic diagno⁃sis，PGD）这种在孕前阻断耳聋出生缺陷的方法，将预防关口前移，真正做到耳聋的一级预防。

1 单基因遗传病胚胎植入前诊断历史及新进展

胚胎植入前诊断（preimplantation genetic diag⁃nosis，PGD）概念的提出始于1967年，Edwards和Gardner[5]对兔囊胚期胚胎成功进行了性别鉴定，但之后的20余年受到试验技术和方法的制约，PGD没有得到进一步的发展。直到1990年Handyside[6]对卵裂球进行活检，应用Y染色体特异性重复序列PCR扩增的方法对胚胎进行性别鉴定，避免了X连锁隐性遗传病男性患儿的出生。之后随着PGD相关技术的不断进展，其临床应用范围也不断扩大。PGD技术首次被应用于单基因病是在1992年，Handyside[7]报道了对常染色体隐性遗传的囊性纤维化患者进行了成功的PGD。他们应用复合巢式PCR的方法扩增目的基因片段，通过单链构象多态性凝胶电泳分析目的基因片段的基因型，选择植入一枚携带单等位基因突变的杂合子卵裂球植入受试者子宫，成功地诞生了一个健康的女性婴儿。之后全世界多家生殖中心陆续报道了多种单基因遗传病的PGD成功案例。1994年，Griffin[8]等人首次报道将原位荧光杂交（fluorescent in situ hybridiza⁃tion，FISH）的技术引入PGD过程，对胚胎细胞的性染色体进行区分，成功使9位受试者受孕，并无一例误诊。FISH技术能够提高性别选择的准确性，并能同时检测性染色体和多条常染色体的拷贝数，该技术被广泛用于胚胎染色体疾病的诊断,直到2000年才被更加准确、能够全面检测染色体组的比较基因组杂交技术（Comprehensive chromosom⁃al hybridization，CGH）所取代。2004年，Handyside AH[9]和HellaniA[10]几乎同期报道了多重替代扩增（multiple displacement amplification，MDA）技术进行单细胞全基因组扩增在PGD领域中的应用，他们分别以单细胞MDA产物为模板成功扩增囊性纤维化、地中海贫血相关基因和多个微卫星重复序列，验证了该方法的有效性和准确性，并预测这种恒温全基因组扩增的方法可以代替之前以PCR为基础的各种方法，成为PGD标准程序的第一步，适用于所有已知单基因遗传病。可以说，MDA技术开启了PGD领域的新时代。

Karyomapping技术是近年来发展起来的一种PGD新技术,2015年首次报道应用于临床[11]。这种技术在同样以全基因组扩增为基础，基于二代测序技术扫描全基因组范围内大于300,000个SNP标记，进行染色体筛查。同时，通过位于目标基因区域的SNP标记，建立单倍体型，通过连锁分析推测胚胎是否携带致病突变。这个技术的特点是无需进行前期实验，无需针对每一个遗传病家庭进行个体化PGD方法设计，可以直接应用于几乎所有单基因遗传病。有专家认为，Karyomapping技术是目前单基因遗传病领域的里程碑式的新技术[12,13]。但Karyomapping技术的问题在于数据量大，需要花费大量的人力进行数据分析及处理，并由此导致检测成本很高。同年Li Yan等发表了一种基于MAL⁃BAC全基因组扩增的新单基因遗传病PGD方法，被命名为突变位点联合非整倍检测及连锁分析（mutated allele revealed by sequencing with aneuploi⁃dy and linkage analyses，MARSALA）[14]。他们首次提出可以通过一次低深度的二代测序同时进行连锁分、突变位点检测及PGS。并成功地实现了针对一例多发软骨瘤家庭的胚胎植入前诊断。

PGD最初被用于耳聋基因是在2009年，分别由以色列的Gheona A[15]和台湾的C.CWu[16]报道。Gheona A等在2004年至2009年期间，对14对分别为GJB235delG、GJB2167delT以及GJB6/D13S1830杂合突变的携带者夫妇进行PGD，他们选取了GJB2和GJB6基因周围12个STR位点，用复合巢式PCR的方法同时扩增突变的基因片段和具有杂合性的STR片段进行诊断，其中8对夫妇获得了成功妊娠。台湾的C.CWu课题组为一对SLC26A4919A＞G突变携带者夫妇进行了PGD并成功生育一个表型正常的女婴。该课题组应用单细胞全基因组扩增（MDA）联合目的基因扩增和引物延伸微测序技术进行基因型的辨别。2015年，解放军总医院报道了一例GJB2基因PGD的成功案例，同样是应用复合巢式PCR的方法，联合STR连锁分析筛选出一枚携带者胚胎植入并获得成功妊娠[17]。这些成功案例在遗传性耳聋的预防取得了很大的突破，但技术上仍然有一定的限制。例如未对胚胎进行染色体扫描、复合巢式PCR诊断成功率低、对家庭个体化实验设计耗时耗力等。因此，针对耳聋的PGD尚未规模展开。

2 胚胎植入前诊断的技术流程

PGD建立在人工辅助生殖技术基础上（Assist⁃ed Reproductive Technology，ART）俗称试管婴儿，其中体外受精-胚胎移植（IVF-ET）被称为第一代试管婴儿，应用卵母细胞胞浆内单精子注射技术（ICSI）的称为第二代试管婴儿。进行胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的被称为第三代试管婴儿。PGD需要取胚胎少量细胞进行检测，必须严格避免多余精子的污染，因此常规体外受精的方法不能满足检测要求，必须应用单精子卵胞浆内注射(intra⁃cytoplasmic sperm injection，ICSI)的方法进行人工受精。临床上PGD的流程包括了促超排卵、ICSI、胚胎体外培养及活检、遗传学检测及胚胎植入的一系列过程。

2.1 胚胎活检技术

为了取得胚胎的遗传物质，需要对其进行活检，取得一定数量的细胞进行后续检测。目前极体活检、卵裂球活检、囊胚活检是主流技术，可根据检测需求不同选择相应的活检方式。

2.1.1 极体活检（polar body diagnosis，PBD）：初级卵母细胞经过第一次减数分裂排出含有二倍体染色体的第一极体并形成次级卵母细胞。次级卵母细胞的姐妹染色单体分离，进行第二次减数分裂，排出具有与卵母细胞相同染色单体的第二极体。极体和卵母细胞的核型相互对应，因此可以通过检测极体来推断卵母的染色体状态和基因型。极体对胚胎发育不产生作用[18]，取出后不影响胚胎的完整性和其后的生长发育，具有极大的优势，但由于其只能反应母源DNA情况，应用受到一定的限制。目前我们常见的耳聋基因包括GJB2及SLC26A4基因均为常染色体隐性遗传，我们需要获得父源遗传信息，因此不能应用极体活检的方式。而针对母源的常染色体显性遗传性耳聋，可以采取此种方式进行活检。

2.1.2 卵裂球活检：胚胎培养至第三天时形成卵裂球，内含6～8个细胞，此时经透明带打孔吸取1～2个细胞进行活检称为卵裂球活检。目前国内外大部分生殖医学文献报道的成功PGD案例选择此种方法进行活检[19]。卵裂球活检的方法能够直接得知胚胎的染色体情况和基因型，同时获得父源、母源的基因信息，较极体活检更为可靠。但于8细胞期胚胎获取1～2个细胞损失了胚胎的总遗传物质，是否对胚胎的发育安全产生影响一直以来是各个生殖医学中心探索的重点问题。研究显示，8细胞期活检较6细胞期更为安全；取出1～2个细胞后囊胚期细胞数量会有所减少，但不改变内细胞团和滋养外胚层细胞的比例；经活检后的囊胚形成率在53%～65%。因此主流观点认为卵裂球8细胞期活检对胚胎的体外发育能力、着床能力和体内发育能力影响不大。从远期影响来看，在小鼠模型上能观察到胚胎活检可能对成年后神经系统退行性病变造成影响，但由于目前世界最早的PGD成功案例是1990年报道，至今还未到老龄，还需长期随访观察。

2.1.3 养外胚层活检：随着胚胎体外培养的技术不断发展更新，更多的胚胎可以在体外培养成为早期囊胚，使得滋养外胚层细胞活检成为可能。而玻璃化冷冻胚胎技术的出现，大大延长了囊胚活检可供诊断时间，并且在子宫内膜容受性最佳的情况下解冻、移植胚胎，最大限度地提高可供尝试的妊娠次数，同时显著增加单胎妊娠和累积妊娠率[20]。囊胚活检的最大优势在于能够获得4～5个细胞用于后续检测，同时不破坏发育成胎儿的内细胞团结构，胚胎嵌合率低，获得更多的细胞数量对于有序检测的准确性有着至关重要的意义，尤其是对于单基因疾病的诊断，提高初始模板量，降低等位基因脱扣率对诊断结果有直接影响[21]。

2.2 全基因组扩增技术

由于单细胞DNA的含量仅为1pg，所以PGD检测得以实现需要建立在目标基因扩增的基础上。PGD出现的早期，胚胎基因型的检测依赖于PCR技术。将细胞裂解后直接进行目标基因片段和连锁标记的PCR。为了提高扩增的特异性，巢式PCR、多重荧光PCR等技术被逐渐引入。单细胞PCR的条件较为苛刻，尤其是多重PCR扩增多个DNA片段时，存在PCR条件摸索困难和扩增失败率高的问题。因此基于PCR的检测方法逐渐被单细胞全基因组扩增所代替。在全基因组扩增（whole ge⁃nome am⁃plification，WGA）可以对单个细胞的全基因组进行非选择性的扩增，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。获得覆盖度高、保真性好的全基因组扩增产物是进行后续检测的前提。

2.2.1 基于PCR的全基因组扩增：在2002年以前，WGA常用的方法有IRS-PCR（interspersed repeatse⁃quence PCR）、LA-PCR（linkeradaptor PCR）、T-PCR（Tagged-PCR）[22,23]、简并寡核苷酸引物PCR（degen⁃erate oligonucleotide primed PCR）[24]、扩增前引物延伸PCR（primer extension preamplification PCR）等。其中最具代表性方法是后两者。但是由于扩增均衡性差，产物片段较短（小于1kb）以及存在非特异性扩增等缺点，其应用范围受到了一定的限制。

2.2.2 多重替代扩增（multiple displace mentamplifi⁃cation，MDA）：2002年Dean[25]等人首次报道了应用多重替代扩增技术进行单细胞全基因组扩增。MDA是一种非PCR基础的恒温WGA方法。该技术的最大优势在于∮29DNA聚合酶的高保真性。在30℃恒温条件下，随机的六碱基引物在多个位点与环状模板DNA结合退火,依靠∮29DNA聚合酶的作用，多个引物结合位点同时复制,取代模板的互补链,被置换的合成DNA链又作为模板来进行下一次扩增。MDA的扩增产物长度在2～10kB之间，平均长度大于10kb。由于MDA方法扩增效率高，保真性好，序列长度能符合下游的多种检测，被广泛应用于定量PCR、snp基因型分析、染色体图谱等后续分析。MDA技术从发明至今一直是单基因病PGD流程中的主流扩增方法，在各种单基因遗传病PGD成功案例中均有报道[26-28]。

图1 A.随机六碱基引物滚动扩增环状DNA模板（箭头指向3’端，粗线表示引物）；B.第二次扩增以第一次扩增产物为模板；C.随着时间扩增产物逐渐增加；D.琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物长度大于10kb[25]。Fig.1 A.Rolling amplification of circular DNA template with random six base primers（Arrows point to 3’end,Thick lines represent primers）;B.The second amplification was based on the template of the first amplified product;C.The product increased gradually along with the time;D.Agarose gel electrophoresis showed that the length of amplified product was more than 10KB.

2.2.3 多重退火环状循环扩增（multiple annealing and looping-based amplification cycles，简称 MAL⁃BAC)：著名华人科学家、美国国家科学院院士、哈佛大学终身教授谢晓亮研究小组于2012年发明了多重退火环状循环扩增[29]不同于以往的非线性或指数型扩增方法，MALBAC技术利用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而很大程度上防止了DNA的指数性扩增，从而解决了基因组扩增对微量初始模板过大的扩增偏倚，降低并使基因组测序的模板需求量从μg级降至单细胞水平，同时保持90%以上的基因组扩增覆盖度。MALBAC技术在辅助生殖胚胎植入前诊断（IVF-PGD）方面具有强大的潜力。应用在PGD过程中可以同时检测染色体微缺失、重复和单基因疾病，对于筛选健康的卵细胞，提高

植入成活率有巨大的意义。这是基于PCR的全基因组扩增和MDA方法做不到的[14]。但MALBAC的保真度较MDA差，SNV的假阳性率高于MDA，在二代测序结果分析时需要对数据进行校正。

图2 MALBAC技术原理[29]Fig.2 TechnicalprincipleofMALBAC[29]

2.2.4 转座子插入线性扩增（Linear amplification via transposon insertion，LIANTI）：2017年4月谢晓亮研究小组发表了关于转座子插入线性扩增的新的全基因组扩增方法[30]。该方法通过特殊设计的LIANTI转座子将目标DNA片段化。LIANTI转座子由一个19bp双链转座酶结合位点和单链T7环状启动子组成。同摩尔量的转座子和Tn5转座酶混合后形成二聚体转座复合体。单细胞的基因组DNA被转座复合体随机地片段化。通过T7 RNA聚合酶转录DNA片段并线性复制获得RNA片段。再通过逆转录获得DNA产物。不同于MALBAC的线性扩增+指数扩增以及MDA的完全指数扩增，这种方法是完全的线性复制过程，能够获得均一性更强的扩增产物。这种优势使LIANTI方法在CVN检测时更具有优势。同时LIANTI扩增保真性优于MDA，测序结果中SNP的假阳性率低。目前LIAN⁃TI尚未应用于任何人工生殖先关领域。需要更多的研究，进一步对其实用性进行检验。

图3 LIANTI技术原理[30]A.二聚体转座复合体形成；B.模板DNA随机片段化-线性扩增-逆转录Fig.3 Technical principle of LIANTI[30]A.LIANTI transposon consists of a 19-bp double-stranded transposase binding site and a single-stranded T7 promoter loop.Equalmolar amounts of LIANTI trans poson and Tn5 trans posase aremixed and dimerized to form LIANTI transposome;B.Genomic DNA random ly fragmented and tagged by LIANTI transposon-Linear amplification-reverse transcription.

3 胚胎植入前染色体筛查（preimplantation genome screen，PGS）

人类自然排卵以及精子细胞存在一定比例的染色体异常（非整倍体），包括大片段的缺失、重复等。文献报道促超排卵产生的卵细胞染色体异常率要更高一些，且随着女性年龄的增长，卵母细胞染色体异常的概率会越来越高。Munne[31]等对超过6，000个胚胎进行染色体非整倍体筛查分析后发现35岁以下女性胚胎染色体非整倍体率为56%～70%，41岁以上女性胚胎染色体非整倍体率79%～88%。染色体异常的胚胎大部分植入后不能成活，少部分可以造成严重的出生缺陷，如唐氏儿等。在诊断单基因遗传病的同时对染色体异常进行诊断有助于提高胚胎植入成活率，同时预防严重出生缺陷。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridiza⁃tion,FISH)是早期进行PGS的主要手段，但由于其信号判读的主观性比较强且只能检测2～15条染色体，不能全面反映胚胎染色体状况，目前已经逐渐被其他检测方法所代替。比较基因组杂交[32-34]（Comprehensive chromosomal hybridization，CGH）自2000年后开始广泛应用，其优点在于可以一次反应检测所有的染色体，缺点是不能检出小片段异常和平衡异位。近年来二代测序技术迅速发展和成本的降低，为PGS提供了一个很好的选择，一些生殖中心开始将二代测序技术应用于胚胎细胞非整倍体的检测。Treff等[35]运用二代测序技术对PGD单基因病进行诊断，他们推测应用二代测序技术可以在进行单基因病突变位点诊断的同时对染色体非整倍体、平衡异位进行诊断。国内外的研究[36-37]一致认为，二代测序的方法更加快捷廉价，且检测的灵敏度和特异度高，弥补了其他技术不能检测小片段异常和平衡异位的不足，有很好的应用前景。

4 连锁分析

无论基于PCR还是单细胞全基因组扩增，在单基因遗传病的诊断中，等位基因脱扣（Allele dropout，ADO）都不能被完全避免，等位基因脱扣指杂合子的其中一条等位基因扩增失败，会导致误诊的出现。应用目标基因连锁不平衡区域内的DNA标记进行单倍体分型和连锁分析能够间接推测出胚胎是否携带父母的致病突变，从而修正由于等位基因脱扣而产生的诊断错误。欧洲人类生殖与胚胎协会PGD分会在2005年的PGD实施指南中建议在PGD检测过程中加入多态性位点进行污染控制和连锁分析，避免误诊[38]。

4.1 短串联重复序列（short tandem repeats，STR）又称微卫星DNA（microsatellite），广泛存在于人类基因组中，以2～7个碱基为单位串联重复构成DNA序列，每个单位重复数的不同构成了STR基因座的多态性[39]。Dreesen[40]在2002年首次报道了应用STR作为连锁标记对囊性纤维化进行PGD。此后由于STR多态性好、片段长度易于PCR扩增、可以与单细胞WGA结合使用的特点被广泛应用于PGD的连锁分析，在明确胚胎基因型的同时还能鉴别外源污染。在很长一段时间里，STR被作为PGD流程中的首选连锁标记。

4.2 单核苷酸多态性(single nucleotide polymor⁃phism，SNP)指DNA序列中的某个位点由于单核苷酸的变化而引起的多态性，在群体中的频率＞1%，SNPs在基因组中数量多，分布广泛，每个个体至少携带300万个SNPs，平均300～1000bp中就有一个SNP。有学者推测基因组中约有1000万个SNP。同时每一代中每个核苷酸变异频率极低，相对稳定，适合作为遗传标记。与STR相比，SNP的数量更多，且有利于高通量自动化的检测和分析。现在逐渐成为连锁分析及建立单倍体型的常用遗传学标记。

综上所述，我国目前遗传性耳聋的流行病学调查数据完善，随着检查技术的不断完善，确诊率得到了很大提高[41]。无论是耳聋家庭还是育龄正常人群，对采取干预手段预防耳聋出生缺陷都有强烈的需求[42]。与此同时，单基因遗传病的胚胎植入前诊断方法在过去的30多年发展迅速，全随着二代测序技术、单细胞全基因组扩增技术的不断发展，针对胚胎单细胞诊断的方法也在不断进步，其准确性、成功率都有了极大的提高。应用二代测序技术、单基因遗传病及染色体筛查同时进行是目前PGD领域的关注热点。目前针对耳聋基因的胚胎植入前诊断尚未规模化展开，方法也需要进一步的改进和完善。亟需设计可行性强、准确性高的遗传性耳聋PGD方法，建立临床流程与策略，便于推广应用于临床，为耳聋家庭提供人性化、更加符合医学伦理的出生缺陷干预措施，整体提升我国耳聋预防的水平。

1 孙喜斌,于丽玫,曲成毅等.中国听力残疾构成特点及康复对策[J].中国听力语言康复科学杂志.2008,27(2):21-24.Sun XB,Yu LM,Qu CY,et al.An Epidemiological Study on the Hearing-Impaired Population Identified in China and Proposed Intervention Strategies[J].Chinese Scientific Journal of Hearing and Speech Rehabilitation,2008,27(2):21-24.

2 戴朴.重视中国聋人群体中遗传性耳聋筛查和预防工作[J].中国听力语言康复科学杂志,2008,3:10-11.Dai P.Screening and Prevention of Hereditary Deafness Among the Deaf Population in China[J].Chinese Scientif⁃ic Journal of Hearing and Speech Rehabilitation,2008,3:10-11.

3 胡浩，邬玲仟，梁德生，等．学语前性耳聋疾病相关基因的产前诊断[J].中华妇产科杂志，2005，40：591-594．Hu H,Wu LQ,Liang DS,et al.Prenatal Diagnosis of Prelin⁃gual Deafness by Determination of SLC26A4 Gene Muta⁃tion[J].Chinese Journal of Obstetrics and Gynecology,2005，40：591-594．

4 韩明昱,卢彦平,边旭明等.213个遗传性耳聋家庭的产前诊断和生育指导[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志；2012,47(2):127-131 Han MY,Lu YP,Bian XM,et al.Prenatal Genetic Testand Clinical Guidance for 213 Hereditary Deaf Families[J].Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,2012,47(2):127-131.

5 Edwards RG,Gardner RL.Sexing of Live Rabbit Blasto⁃cysts[J].Nature,1967,214(5088):576-577.

6 Handyside AH,Kontogianni EH,Hardy K,et al.Pregnan⁃cies from Biopsied Human Preimplantation Embryos Sexed by Y-specific DNA Amplification[J].Nature,1990,344(6268)：768-770.

7 Handyside AH,Lesko JG,Tarin JJ,et al.Birth ofa Normal Girl after In Vitro Fertilization and Preimplantation Diag⁃nostic Testing for Cystic Fibrosis[J].N.Engl.J.Med,1992,327(13)：905–909.

8 Griffin DK,Handyside AH,Penketh RJ,et al.Fluorescent In-situ Hybridization to In terphase Nuclei of human Pre⁃implantation Embryos with X and Y Chromosome Specific Probes[J].Hum Reprod,1991,6(1):101-5.

9 Hellani Ali,Coskun Serdar,Benkhalifa Moncef,et al.Mul⁃tiple Displacement Amplification on Single Celland Possi⁃ble PGD Applications[J].Mol Hum Reprod,2004,10(11):847-52.

10 HellaniA,Coskun S,TbakhiA,et al.Clinical Application of Multiple Displacement Amplification in Preimplanta⁃tion Genetic Diagnosis[J].Reprod Biomed Online.,2005,10(3):376-80.

11 Konstantinidis M,Prates R,Goodall N,et al.Live Births Following Karyomapping of Human Blastocysts:Experi⁃ence from Clinical Application of the Method[J].Reprod.Biomed.,Online doi:10.1016/j.rbmo.2015.05.018;

12 Thornhill AR,Handyside AH,OttoliniC,et al.Karyomap⁃ping-a Comprehensive Means of Simultaneous Monogenic and Cytogenetic PGD:Comparison with Standard Ap⁃proaches in Real Time for Marfan Syndrome[J].JAssist Reprod Genet,2015,32(3):347-56.

13 Handyside AH.Live Births Following Karyomapping-a"Key"Milestone in the Development of Preimplantation Genetic Diagnosis[J].Reprod Biomed Online.,2015,31(3):307-8.

14 Yan LY,Huang L,Xu LY,et al.Live Births after Simulta⁃neous Avoidance ofMonogenic Diseases and Chromosome Abnormality by Next-generation Sequencing with Link⁃age Analyses[J].ProcNatlAcadSci USA,2015,112(52):15964-9.

15 Altarescu G,Eldar-Geva T,Brooks B,et al.Preimplanta⁃tion Genetic Diagnosis(PGD)for Nonsydromic Deafness by Polar Body and Blastomere Biopsy[J].JAssistReProd Gen⁃et,2009,26(7):391-39.

16 Wu CC,Lin SY,Su YN,et al.Preimplantation Genetic Diag⁃nosis(Embryo Screening)for Enlarged Vestibular Aque⁃duct due to SLC26A4 Mutation[J].AudiolNeurotol,2010,15:311-317.

17 XiongWP,Wang DY,Gao Y,et al.Reproductive Manage⁃ment through Integration of PGD and MPS-based Nonin⁃vasive Prenatal Screening/Diagnosis for a Family with GJB2-associated Hearing Impairment[J].SciChina Life Sci,2015,58(9):829-38.

18 Verlinsky Y,Ginsberg N,Lifchez A,et al.Analysis of the First Polar Body:Preconception Genetic Diagnosis[J].Hum Reprod,1990,5:826–829.

19 Harper JC,Wilton L,Traeger SJ,et al.The ESHRE PGD Consortium:10 Years of Data Collection[J].Hum Reprod Update,2012,18:234–24.

20 薛林涛,黄莉,何冰等.囊胚期胚胎活检及玻璃化冻存的研究[J].中国临床新医学，2014,7（7）：596-599.Xue LT,Huang L,He B,et al.Impact of Blastocyst Biopsy on the Embryos Development Potential and Survival Rate after Vitrification[J].Chinese Journal of New Clinical Med⁃icine,2014,7（7）：596-599.

21 Scott KL,Hong KH,ScottRT,et al.Selecting the Optimal Time to Perform Biopsy for Preimplantation Genetic Test⁃ing[J].Fertil Steril,2013,100(3):608-614.

22 BarrettMT,Reid BJ,Joslyn G.Genotypic AnalysisofMul⁃tiple Loci in Somatic Cells by Whole Genome Amplifica⁃tion[J].Nucleic Acids Res.,1995,23:3488–92.

23 Zhang L,Cui X,Schmitt K,et al.Whole Genome Amplifi⁃cation from a Single Cell:Implications for Genetic Analy⁃sis[J].PNAS,1992,89:5847–51.

24 Cheung VG,Nelson SF.Whole Genome Amplification Us⁃ing a Degenerate Oligonucleotide Primer Allows Hun⁃dreds of Genotypes to be Performed on Less than One Nanogram of Genomic DNA[J].Proc Natl Acad Sci U SA,1996,93(25):14676-14769.

25 Dean FB,Nelson JR,Giesler TL,et al.Rapid Amplifica⁃tion of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Poly⁃merase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification[J].Genome Res.2002,11:1095–1099

26 Ren Z,Zeng HT,Xu YW,et al.Preimplantation Genetic Diagnosis for Duchenne Muscular Dystrophy by Multiple Displacement Amplification[J].Fertil Steril.,2009,91(2):359-64.

27 LledóB,Bernabeu R,Ten J,et al.Preimplantation Genet⁃ic Diagnosis of X-linked Adrenoleukodystrophy with Gen⁃der Determination Using Multiple Displacement Amplifi⁃cation[J].Fertil Steril,2007,88(5):1327-33.

28 Lu YP,Peng HM,Jin ZG,et al.Preimplantation Genetic Diagnosis for a Chinese Family with Autosomal Recessive Meckel-Gruber Syndrome Type 3(MKS3)[J].PLoSOne,2013,8(9):e73245.

29 Zong CH,Lu SJ,Chapman AR,et al.Genome-wide De⁃tection of Single-Nucleotide and Copy-number Varia⁃tions of a Single Human Cell[J].Science,2012,338(6114):1622-6.

30 Chen CY,Xing D,Tan LY,et al.Single-cellWhole-ge⁃nome Analysesby Linear Amplification via Transposon In⁃sertion(LIANTI)[J].Science,2017,356(6334):189-194.

31 MunnéS,Chen S,Colls P,et al.Maternal Age,Morpholo⁃gy,Development and Chromosome Abnormalities in over 6000 Cleavage-stage mbryos[J].Reprod Biomed Online,2007,14(5):628-34.

32 韩丹,陈大蔚,曹云霞,周平.Array-CGH技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用进展[J].中华临床医师杂志（电子版）,2015,(06):976-979 Han D,Chen DW,Cao YX,et al.Application of the Mi⁃cro-array Comparative Genomic Hybridization Technolo⁃gy in Preimplantation Genetic Diagnosis[J].Chinese Jour⁃nal of Clinicians(Electronic Edition),2015,(06):976-979.

33 何玺玉,陈晓春,李然,李培,陆爱梅.微阵列比较基因组杂交技术对不明原因智力低下/生长发育迟缓患儿的分子诊断[J].中国当代儿科杂志,2015,(05):459-463.He XY,Chen XC,LIR,et al.Molecular Diagnosis of Chil⁃dren with Unexplained Intellectual Disability/Develop⁃mental Delay by Array-CGH[J].Chinese Journal of Con⁃temporary Pediatrics,2015,(05):459-463.

34 王静,丁晨晖.array CGH和SNParray技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用比较[J].实用医学杂志,2015,(17):2822-2825,2826.Wang J,Ding CH.Comparison of CGH Array and SNPAr⁃ray in Preimplantation Genetic Diagnosis[J].The Journal of PracticalMedicine,2015,(17):2822-2825-2826.

35 Treff NR,Fedick A,Tao X,et al.Evaluation of Targeted Next-Generation Sequencing-based Preimplantation Ge⁃netic Diagnosis of Monogenic Disease[J].Fertil Steril,2013,99(5):1377-1384.

36 Yin XY,Tan K,Vajta G,et al.Massively Parallel Se⁃quencing for Chromosomal Abnormality Testing in Troph⁃ectoderm Cells of Human Blastocysts[J].Biologh of repro⁃duction,2013,88(3):691-696.

37 Fiorentino F,Biricik A,Bono S,et al.Developmentand Val⁃idation of a Next-generation Sequencing-based Protocol for 24-chromosome Aneuploidy Screening of Embryos[J].Fertil Steril,2014,101(5):1375-82.

38 Thornhill A R,deDie-Smulders C E,Geraedts JP et al.ESHRE PGD Consortium'Best Practice Guidelines for Clinical Preimplantation Genetic Diagnosis(PGD)and Preimplantation Genetic Screening(PGS)[J].Hum Reprod,2005,20:35-48.

39 Weissenbach J,Gyapay G,Dib C,et al.A Second-genera⁃tion Linkage Map of the Human Genome[J].Nature,1992,359(6398):794-801.

40 Dreesen JC,Jacobs LJ,Bras M,et al.Multiplex PCR of Polymorphic Markers Flanking the CFTR Gene;a General Approach for Areimpl antation Genetic Diagnosis of Cystic Fibrosis[J].Mol Hum Reprod.2000,6(5):391-6.

41 朱俊真,曹琴英,葛军,等.耳聋患者相关常见致病基因的分子诊断[J].中华耳科学杂志,2013,4(11):575-577.ZhuJZ,Cao QY,GeJ,et al.Molecular Diagnosis of Deafness Patients in Related Pathogenic Gene[J].Chinese Journal of otology,2013,4(11):575-577.

42 韩明昱,楚严,卢彦平,等.孕期女性常见耳聋基因筛查与耳聋出生缺陷干预[J].中华耳科学杂志,2011,9(3)：289-295.Han MY,Chu Y,Lu YP,et al.Screening of Common Deaf Gen⁃esin Pregnant Womenand Management of Deafness at Birth[J].Chinese Journal of otology,2011,9(3)：289-295.