棘阿米巴表达文库的免疫学筛选

张宏梅 ， 郑文彧 ， 刘 迪 ， 时文艳 ， 孙宏宇 ， 崔佰吉 ， 高俊涛 ， 冯宪敏

(1.吉林医药学院病原生物学教研室 ， 吉林 吉林 132013 ； 2.吉林市中心医院 ， 吉林 吉林 132000)

棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba Keratitis，AK)是一种严重威胁视力的感染性眼病, 其发生与一定的危险因素有关，如配戴角膜接触镜、接触污染的水源、角膜轻度擦伤，以及机体抵抗力降低等[1-2]。目前为止，对棘阿米巴原虫的研究主要集中在形态分型、基因分型、药物杀伤试验、感染模型和致病机制研究阶段，对于棘阿米巴角膜炎的病因学、免疫学、病理生理学以及诊断治疗等方面的研究仍有待深入。在前期工作中，课题组成功构建了棘阿米巴原虫滋养体全长cDNA文库[3]和棘阿米巴角膜炎的兔模型[4]。本文通过棘阿米巴感染兔血清对构建好棘阿米巴原虫滋养体全长cDNA文库进行免疫学筛选，以期获得高反应原性的抗原基因，为进一步棘阿米巴原虫感染的快速诊断试剂和免疫预防分子的筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫株 棘阿米巴原虫标准虫株(Acanthamoebahealyi)由延边大学病原教研室惠赠，本室冻存。将棘阿米巴原虫纯培养于蛋白胨-酵母-葡萄糖培养基(Peptone-Yeast-Glucose, PYG)中, 取对数生长期的滋养体， 生理盐水调整原虫浓度为1×106/mL(90%以上滋养体)，并用台盼蓝染色检测虫体活力>90%，用于试验。

1.2 试剂与仪器 棘阿米巴cDNA和原始cDNA文库由本室制备，-80 ℃冷冻保存[3]。E.coliXL1-Blue，PBST，辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG，RNA提取试剂盒，cDNA合成试剂盒，2×TaqPCR Green Mix，引物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

1.3 免疫血清制备

1.3.1 感染兔模型 健康新西兰白兔6只(吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供)，体重2.0～2.5 kg，雌雄兼用。试验组4只，对照组2只。试验组单眼注射，左眼为试验眼,右眼为病变对照眼。实验前实验眼用0.5%氢化可的松滴眼液点眼, 每天3～4次，共3 d。实验开始后,停用激素。试验组兔固定后，经氯胺酮肌肉注射全麻后，左眼再经0.5%可卡因点眼局麻,用1 mL无菌注射器向实验眼角膜基质内注射棘阿米巴原虫混悬液0.2 mL(1×106/mL)，2只对照兔左眼角膜基质内注射等量生理盐水，右眼未做处理。于注射12 h开始，每天观察兔眼角膜病变情况，直到处死(42 d)[5]。

1.3.2 10%氢氧化钾湿封片镜检 分别于注射后3 d、7 d、14 d及28 d，刮取兔角膜较深层病变组织涂于滴加10%KOH的载玻片上，置于光学显微镜下查找滋养体或包囊。

1.3.3 血清抗体滴度检测 分别于感染后第1、7、14、21、28、35、42天耳缘静脉或动脉取血，制备血清，采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测兔血清中抗棘阿米巴原虫抗体的滴度。将棘阿米巴虫体粗抗原(浓度为1.63 2 mg/mL)稀释至10 μg/mL，按每孔100 μL包被96孔板，4 ℃过夜。次日用0.05 mol/L pH值7.4的PBS-Tween-20(PBST)洗液洗涤3次，每次5 min；3%脱脂奶粉每孔100 μL封闭1 h，PBST洗涤后，加入稀释的兔血清(1∶4 000,1∶8 000,1∶16 000, 1∶32 000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤后，加入1∶5 000稀释的二抗(bs-0295G-HRP rabbit IgG/HRP，公司)，37 ℃孵育5 h；PBST洗涤后，以TMB为底物显色10 min，4 mol/L硫酸终止反应，用bio-rad 680酶标仪(美国)测定OD450值。

1.4 cDNA文库滴度测定 取1 μL原始文库，用1×λ dilution Buffer 分别进行1×10-3、1×10-4和1×10-5倍稀释。从每个浓度分别吸取1 μL加入至100 μLE.coliXL1-Blue感受态细胞，37 ℃孵育15 min。将上述混合液与6 mL LB/MgSO4/麦芽糖软顶琼脂混合后倾注平板，室温冷却，于37 ℃培养16～18 h。计数溶菌斑数量，以确定该文库的滴度。

1.5 cDNA文库免疫筛选 1×10-3稀释的棘阿米巴cDNA文库0.5 μL，加入至100μLE.coliXL1-Blue感受态细胞，37 ℃孵育15 min。将上述混合液与6 mL LB/MgSO4/麦芽糖软顶琼脂混合后倾注平板，室温冷却，于37 ℃培养16～18 h，至噬菌斑清晰可见，未融合。将预先准备好的140 mm直径的PVDF膜覆盖于噬菌斑表面，标记固定，37 ℃正置孵育4 h，4 ℃倒置过夜。取下PVDF膜，PBST洗涤3次后，5%脱脂奶粉室温封闭1h，洗涤后首抗和二抗各自孵育1 h，DAB显色。首抗：分别取1 μL感染后第7、14、21天和28天兔血清，混合后，与E.coliXL1-Blue裂解液室温混合过夜；次日2 000×g，室温离心10 min，收集上清，用抗体稀释液进行1∶5000 稀释。二抗：辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG，使用浓度1∶500。从培养板上挑取阳性克隆置于1.5 mL离心管中，加入50 μL 1×λdilution Buffer，4 ℃过夜；次日离心取上清进行复筛和测序。

1.6 阳性克隆测序与序列分析 将上述噬菌体溶液送北京鼎国昌盛生物技术有限公司采用通用引物T3和T7进行双向测序。根据测序结果，采用ORF finder软件进行ORF预测,并对预测的氨基酸序列进行Blastp同源性分析。同时根据碱基序列设计特异性引物，以棘阿米巴cDNA为模板进行扩增检测，PCR反应体系为：2×TaqPCR Green Mix，12.5 μL；Ameba cDNA，0.5 μL；引物F/R各1 μL；无核酸酶的去离子水至总体积25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；92 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶，进行电泳，PCR产物回收，进行二次测序。

2 结果

2.1 免疫兔血清制备 在家兔角膜感染棘阿米巴原虫后3、7、14 d及28 d分别作角膜深层组织刮片，滴加10%KOH，置于光学显微镜下观察，4只试验眼均查见滋养体或包囊(图未列出)，表明感染模型构建成功。

分别于感染后第1、7、14、21、28、35、42天耳缘静脉或动脉取血，制备血清，采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测兔血清中抗棘阿米巴原虫抗体的滴度。随着感染的进行,实验组兔血清抗体水平于感染后的第7天开始逐渐升高，第28天达到峰值，而后抗体滴度开始缓慢下降；阴性对照组兔血清抗体水平没有明显变化(图1)。根据抗体水平的变化，选用感染后第7、14、21天和28天兔血清进行文库的免疫学筛选。

图1 兔棘阿米巴角膜炎模型血清抗体滴度的变化

2.2 cDNA文库的免疫学筛选和序列分析 对培养板上的噬菌斑进行计数，计算出cDNA文库滴度为3.88×107PFU/mL。用预吸附的感染兔血清对棘阿米巴原虫cDNA文库进行初筛和复筛，获得3个持续阳性克隆(图2)。根据测序结果，采用NCBI-Blastp对氨基酸序列的同源性进行比对。如表1显示，克隆1插入序列长度为956 bp，含有一个774 bp的开放阅读框架，编码258个氨基酸，分子量大小为29.13 kDa，GenBank注释为肌动蛋白1(actin1)；克隆2插入序列长度为658 bp，含有一个234 bp的开放阅读框架，编码78个氨基酸，分子量大小为8.96 kDa，GenBank注释为聚泛素(polyubiquitin)；克隆3插入序列长度为1 290 bp，含有一个564 bp的开放阅读框架，编码188个氨基酸，分子量大小为21.36 kDa，GenBank注释为热休克蛋白20(HSP20)。

表1 3个阳性克隆序列比对分析

图2 棘阿米巴cDNA文库的免疫学筛选

根据测序结果设计特异性引物，以棘阿米巴原虫cDNA为模板进行PCR扩增鉴定，结果显示，3个阳性克隆全部扩增出特异条带，插入的cDNA片段大小分别为774 bp、234 bp和564 bp(图3)，与序列比对结果一致。

3 讨论

棘阿米巴角膜炎(AK)是由自由生棘阿米巴原虫感染引起的一种致盲性眼病。其发生与一定的危险因素有关，如佩戴角膜接触镜、接触污染的水源、角膜擦伤、眼部外科手术以及机体抵抗力降低等。棘阿米巴原虫的生活史包括滋养体和包囊两个阶段，滋养体的繁殖速度极快，感染包囊3 d内可转变为滋养体，侵入组织或经过治疗后又可以转变成包囊，包囊抵抗力极强，不易被杀灭，故该病治疗预后不良[6-9]。临床诊断的标准为病原学诊断，其样本的采集主要为角膜刮片，诊断率低，不易被患者所接受。此外，由于AK患者早期症状不特异，临床上容易和病毒性或真菌性角膜炎混淆，发生漏诊、误诊和误治，导致疾病的恶化[10-11]。因此对AK感染的预防和早期诊断一直是亟待解决的问题。随着分子生物学和分子免疫学的发展，基因工程重组诊断抗原和分子疫苗的研究成为诊断试剂，以及疫苗研发的重要手段。cDNA表达文库和感染血清筛选是分离和鉴定抗原候选基因的常用方法之一。

前期工作中，课题组通过SMART法构建了棘阿米巴原虫的cDNA表达文库。在本研究中通过角膜注射构建棘阿米巴角膜炎兔模型，并获得用于文库免疫学筛选的感染血清。根据抗体滴度的变化规律，选用感染后第7、14、21天和第28天的混合血清，去除E.coliXL1-Blue交叉反应性后，对文库进行免疫学筛选。经过三轮的初筛和复筛，共得到6个基因的表达产物可以与感染血清发生特异性结合。经序列比对后，其中3个基因(actin1、polyubiquitin和HSP20)在棘阿米巴原虫基因库中具有明确的注释。为进一步的基因克隆，原核表达系统的构建、诱导表达和鉴定，以及AK的免疫诊断和疫苗的研究奠定了基础，但三者在棘阿米巴入侵和致病过程中的作用有待进一步研究。

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