“标本配穴”电针对心肌缺血模型大鼠心脏功能和细胞凋亡指数的影响

赵钢,马莹莹,付嘉明



“标本配穴”电针对心肌缺血模型大鼠心脏功能和细胞凋亡指数的影响

赵钢,马莹莹,付嘉明

(黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040)

通过“标本配穴”电针对针刺心肌缺血大鼠治疗前后心脏功能和细胞凋亡指数影响的实验研究,观察治疗疗效,从而探讨针刺预处理对心肌的保护机制,为临床治疗该病提供科学的方法。40只大鼠按随机数字表分成正常组、模型组、内关组、标配组。采取连续14 d腹部皮下注射异丙肾上腺素造模。正常组、模型组大鼠只抓取固定,不针刺治疗。内关组电针双侧内关,标配组电针双侧内关、关元、双侧足三里,每日治疗1次,共21 d。大鼠于第22天行超声心动图机检测大鼠左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS);TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡指数(AI)。模型组大鼠LVEDd、LVESD高于正常组(＜0.01),而LVEF、LVFS值均低于正常组(＜0.01);内关组和标配组LVEDd、LVESD均低于模型组(＜0.01),标配组低于内关组(＜0.01,＜0.05);内关组和标配组中LVEF、LVFS值均高于模型组(＜0.01),标配组高于内关组(＜0.05)。正常组大鼠心肌AI值低于模型组(＜0.01);内关组、标配组均低于模型组(＜0.01);标配组低于内关组(＜0.05)。电针能够通过降低心肌缺血模型大鼠的LVEDd、LVESD值,提升LVEF、LVFS值,有效改善心肌缺血细胞凋亡导致的代偿性心脏扩张、心功能低下,降低心肌细胞凋亡程度,且“标本配穴”电针法比单纯内关电针法具有更好的效应。

标本配穴;电针;心肌缺血;心脏功能;细胞凋亡指数;大鼠

现今心血管疾病严重威胁着人们的健康,其中心肌缺血是主要病因。针刺作为预防和治疗心肌缺血的有效方法,为人们的健康提供了绿色的治疗方案[1]。研究证明针刺对抗缺血心肌具有确切的保护作用,并且针刺不同腧穴或穴位配伍治疗心肌缺血疗效具有差异性。

心肌缺血发生后心脏室壁心肌组织、心腔结构及心脏功能发生改变,而针对性的治疗可以有效地改善这些状况[2]。本研究通过建立大鼠心肌缺血模型,观察电针尤其是“标本配穴”电针法对大鼠心脏结构功能和心肌组织细胞凋亡状况的影响,以期探索其对心脏的保护效果及保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本课题选用SPF级雄性Wistar大鼠40只,由青岛派特福德白鼠养殖专业合作社提供。饲养室温20～25℃,湿度50%～70%,体重180～220 g。实验动物经BL-420S生物机能实验系统检测心电图无异常。动物喂养于标准动物房,每笼5只。大鼠适应性喂养1周后实验。实验过程严格遵照科技部(2006)398号《关于善待实验动物的指导性意见》文件要求执行[3]。

1.2 实验动物分组及模型制备

40只大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、内关电针组(内关组)、标本配穴电针组(标配组),每组10只。模型组、内关组和标配组大鼠用盐酸异丙肾上腺素(isoproterenolhydrochloride,ISO)2 mg/ (kg·d)腹部皮下注射法[4-5],连续14 d,2周后用BL-420生物机能系统检测模型组大鼠心电图,以QRS波和QT波持续时间延长(QRS＞0.1 s)[6-7];ST段压低(ST＞0.1 mV),T波倒置,作为造模成功的标志[8];正常组大鼠给予等量0.9%生理盐水皮下注射,连续14 d。模型制备过程中无实验大鼠脱落。

参照李忠仁主编的《实验针灸学》[9]取穴,内关位于大鼠前臂下1/6折点处,尺、桡骨缝中,腕横纹正中上5 mm处,针刺深度约2 mm;关元位于大鼠两后肢根部连线的中点,针刺深度约4 mm;足三里位于大鼠膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处,针刺深度约8 mm。

造模后穿自制大鼠固定衣[10],正常组、模型组大鼠只抓取固定,不针刺治疗;内关组针刺双侧内关,标配组针刺内关、关元、足三里,标配组同侧穴位组成一对电极,内关组及标配组单穴在穴位右旁开5 mm处另皮下浅刺一针,作为辅助电极;针刺后连接G6805-Ⅱ电针仪,选连续波,频率2 Hz,电流强度均为1 mA,强度以大鼠出现与电针频率相一致的轻微颤动为宜,通电20 min。每日治疗1次,共21 d。

1.3 结果检测

1.3.1 心脏结构与功能观测

超声心动图检测[11]大鼠左室舒张末期、收缩末期内径、左室射血分数、左室短轴缩短率。大鼠在第22天,经10%水合氯醛腹腔注射麻醉,以备皮刀心前区剃毛,仰卧固定于鼠板上,应用Agilent Sonos 5500型彩色超声心动图诊断仪,10S探头,频率为8 MHz,对大鼠的心脏大小及功能进行检测[12]。检测指标包括左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter,LVESD),并计算出左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)[13]。

1.3.2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)

大鼠在检测心脏彩超后,开胸暴露心脏,迅速摘取大鼠心脏用生理盐水清洗,取心尖组织置于4%多聚甲醛固定备用[14]。检测步骤如下,①将大鼠心室切片100 mg,将其先后用二甲苯、无水乙醇、乙醇(95%、85%、75%梯度脱蜡水化)依次进行浸泡,再用蒸馏水浸泡洗涤2 min。②洗涤后的标本滴入20mg/mL的蛋白酶K液,在20～37℃条件下反应15 min,然后用PBS洗涤3次,每次洗涤5 min。③将装有检测标本的EP管中添加50mL TUNE反应液,在37℃条件下避光孵育60 min,然后放入PBS液中洗涤3次,每次洗涤5 min。④然后在标本上加入50mL过氧化物酶,在37℃条件下避光孵育30 min。⑤再用PBS液洗涤4次,每次5 min,然后添加100mL DAB的显色液,在室温下进行5 min的显色,后用纯净水洗涤使显色终止。⑥将显色后的标本复染,时间控制在30 s至1 min之间,然后用水洗涤,再用1%盐酸乙醇使之分化,后用纯净水冲洗使之返蓝。⑦将复染后的标本用95%乙醇进行脱水,时间为5 min,后用无水乙醇反复脱水2次,每次时间为3 min,二甲苯透明2次,每次时间为2 min,后将标本放入通风橱中进行风干,用中性树胶对标本进行封片[15]。⑧利用显微镜观察晾干后的标本切片。组织切片上的凋亡细胞在显微镜下(放大倍数为100倍和400倍)为棕褐色,采用计数方式标记出标本中心肌凋亡细胞与正常细胞的数目,后计算出细胞的凋亡率[16]。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0 for Windows统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示,并对各组数据先进行正态性检验和方差齐性分析,根据实验数据的类型分析结果选择相应的分析方法,依次采用单因素方差分析(-法)或运用-非参数秩和检验分析。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针对心肌缺血大鼠心脏功能的影响

模型组的左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESD)均高于正常组(＜0.01),左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)均低于正常组(＜0.01)。内关组、标配组中LVEDd值均低于模型组,组间比较差异具有显著统计学意义(＜0.01);标配组中LVEDd值低于内关组,组间比较差异具有显著统计学意义(＜0.01)。内关组、标配组中LVESD值均低于模型组,组间比较差异具有显著统计学意义(＜0.01);标配组中LVESD值低于内关组,组间比较差异具有统计学意义(＜0.05)。内关组、标配组中EF值均高于模型组,组间比较差异具有显著统计学意义(＜0.01);标配组中EF值高于内关组,组间比较差异具有统计学意义(＜0.05)。内关组、标配组中FS值均高于模型组,组间比较差异具有显著统计学意义(＜0.01);标配组中FS值高于内关组,组间比较差异具有统计学意义(＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠LVEDd、LVESD、EF、FS值比较 (±s)

注:与正常组比较1)＜0.05,2)＜0.01;与模型组比较3)＜0.01;与内关组比较4)＜0.05

2.2 电针对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡指数(AI)的影响

模型组大鼠心肌细胞AI值均高于正常组,差异具有显著统计学意义(＜0.01)。内关组、标配组大鼠心肌细胞AI值均低于模型组,差异具有显著统计学意义(＜0.01);标配组心肌细胞AI值低于内关组,差异具有统计学意义(＜0.05)。详见表2。通过组织染色看出标配组与内关组均能有效地改善实验大鼠的心肌缺血情况下心脏生理及心肌功能低下的状况,并且标配组电针法治疗具有更好的疗效。详见图1。

表2 各组大鼠AI值比较 (±s,%)

注:与正常组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01;与内关组比较3)＜0.05

3 讨论

3.1 大鼠处于心肌缺血状态时心脏结构变化及选穴原则

持续、严重的心肌缺血将造成大鼠心肌细胞出现大量的凋亡,进而可导致心脏结构特别是左心室的构型发生病变,表现为缺血区的心室肌出现代偿性增厚,致使左心室腔隙发生缩小[17],进而导致心室肌力减退,泵血功能下降,造成血液动力学障碍和心功能降低[18];电针“标本配穴”法治疗心肌缺血的总有效率达80%以上[19],通过“标本配穴”治疗既可以显著地缓解大鼠心肌缺血引发的心绞痛症状,还可以有效地改善大鼠的心电图及心脏功能,减少心肌细胞的凋亡[20]。腧穴配伍是针灸处方的主要内容之一,其目的是加强腧穴间协同作用,提高疗效。不同腧穴有其特异性,实验研究显示[21],“标本配穴”法是现今电针抗大鼠心肌缺血损伤的最优方法,其显效率优于常规配穴法。

3.2 “标本配穴”可以有效防治心肌缺血损伤

近来有采用中药贴敷、穴位注射中药、激光穴位治疗、穴位埋针以及穴位按摩等方法,与其相比针刺“标本配穴”法治疗心肌缺血的临床显效时间最快、强度可控[21]、物理损伤小并可以增加机体的适应性保护能力改善心肌缺血损伤[22]。

注:A为正常组,B为模型组,C为内关组,D为标配组。标本Harris苏木素染色,组织切片在显微镜下(×400倍)观察凋亡细胞为棕褐色

通过“标本配穴”法治疗可以明显减轻心肌缺血所引起的症状;并且心肌细胞凋亡指数,可以用数据表现出大鼠心肌缺血后心脏出现代偿及心功能低下的情况。针刺可以提升心肌组织的活性,并通过有效抑制缺血细胞凋亡发挥防护作用。“标本配穴”法电针可能通过两方面途径共同参与防治心肌缺血,一方面改善左心室射血分数(EF)和左心室短轴缩短率(FS),并抑制左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESD),从而提高心肌细胞抗损伤能力;另一方面降低心肌细胞凋亡指数(AI),减少心肌细胞凋亡,减轻心室结构功能损伤。实验表明,通过“标本配穴”电针法能够预防及治疗缺血性心脏病,并服务于临床。

3.3 问题与展望

心肌缺血导致的心肌组织细胞凋亡信号通路研究是一个纷繁复杂的调节网络[23],而对这些信号通路进行系统的研究是个复杂庞大的工程。针灸防治心肌缺血性心血管疾病也是一个多通道、多靶点的调控机制[24],每条信号调控途径也并非独自发挥调控作用。本研究中只探讨“标本配穴”对心肌缺血模型大鼠心脏结构、功能和细胞凋亡指数对大鼠心肌缺血的影响,对于分子机制尚未深入剖析。下一步研究可从两个方面进行,一是对心肌缺血过程中相关的基因分子水平调控途径进行研究,探讨已经进行科研的研究,找出关键基因;二是找出对心肌缺血具有直接的影响可能存在的未知的靶基因,为心肌缺血过程中的调控机制进行更清晰的阐释[25]。

综上所述,“标本配穴”电针法具有良好的抗心肌缺血的作用,其机制可能是通过针刺腧穴后的改善心室结构、功能,抑制心肌细胞发生凋亡,从而达到有效保护心肌的效果。

[1] 董晓瑞.中西医结合方法防治心血管疾病[J].中国医药指南,2017,15(8):201.

[2] 戴翠莲,罗开良,姜黔峰,等.蛋白酶体抑制剂对急性心肌缺血再灌注大鼠心脏结构及功能的影响[J].重庆医科大学学报,2010,35(10):1486-1489.

[3] 史晓萍,宗阿南,陶钧,等.《关于善待实验动物的指导性意见》的研究[J].中国医科大学学报,2007,36(4): 493.

[4] 高海成,孙波,苗春生,等.大剂量盐酸异丙肾上腺素诱发大鼠心肌缺血性坏死模型的建立[J].中国生物制品学杂志,2009,22(3):288-290.

[5] 王华,望庐山,梁凤霞,等.电针治疗对慢性心肌缺血大鼠心电图、心肌病理形态及PI3K/Akt信号通路的影响[J].中国针灸,2016,36(4):389-395.

[6] 谢俊,陈泽斌,吴松,等.不同腧穴配伍电针防治大鼠心肌缺血损伤作用的比较[J].针刺研究,2017,42 (2):131-135.

[7] Gao J, Fu W, Jin Z, et al. Acupuncture pretreatment protects heart from injury in rats with myocardial ischemia and reperfusion via inhibition of the beta(1)- adrenoceptor signaling pathway[J]. Life Sci, 2007,80 (16):1484-1489.

[8] 韩军,宣佳利,胡浩然,等.金丝桃苷预处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤作用与PI3K/Akt信号通路的关系[J].中国中药杂志,2015,40(1):118-123.

[9] 李忠仁.实验针灸学[M].第2版,北京:中国中医药出版社,2007:23.

[10] 袁建菱,刘丽,陈小丽,等.一种大鼠固定器:中国, CN201620354700.5[P].2016-11-9.

[11] 宝云龙,曹宪玉,金天亮,等.高频超声心动图与血流动力学检测结合评价扩张型心肌病心力衰竭大鼠心功能实验研究[J].中国分子心脏病学杂志,2015,15 (1):1210-1213.

[12] 路爱青,李全太,孙作忠.经胸超声心动图、心电图、多层螺旋CT冠状动脉造影诊断冠心病的对比研究[J].功能与分子医学影像学杂志(电子版),2015,4(1): 583-587.

[13] Uusitalo V, Luotolahti M, Pietilä M,. Two- dimensional speckle-tracking during dobutamine stress echocardiography in the detection of myocardial ischemia in patients with suspected coronary artery disease[J]., 2016,29(5):470- 479.

[14] 祝晓莹,王桂美,胡敏,等.硫化氢活化ERK抵抗内质网应激诱导的心肌细胞凋亡[J].华中科技大学学报(医学版),2015,44(3):251-257,262.

[15] 袁芳.山楂叶总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达影响[J].辽宁中医药大学学报,2016,18(8):42-45.

[16] 王华,卢继东,吴松,等.电针不同腧穴对心肌缺血模型大鼠细胞凋亡及心肌细胞miRNAs表达的影响[J].中国针灸,2016,36(3):281-286.

[17] 冯艳红,孙海龙,周宇微,等.川穹嗪对急性心肌梗死大鼠心肌的保护作用及机制探讨[J].山东医药,2013,53 (10):11-13.

[18] Reiter M, Twerenbold R, Reichlin T,. Early diagnosis of acute myocardial infarction in the elderly using more sensitive cardiac troponin assays[J]., 2011, 32(11):1379-1389.

[19] 老锦雄,潘清洁.背俞穴温针灸对冠心病无症状性心肌缺血患者心电图及血液动力学的影响[J].针灸临床杂志,2012,28(7):37-39.

[20] 吴红金,郭欢,谢芳.针刺抗心肌缺血机制的实验与临床研究现状[J].中西医结合心脑血管病杂志,2005,3 (5):430-431.

[21] 郭新荣,李娜,吴涛,等.针刺对颅脑损伤模型大鼠血清及脑组织中SOD、MDA含量的影响[J].山东中医杂志, 2013,32(6):423-424.

[22] 王洁.针刺不同配穴对心肌缺血大鼠海马区BDNF、TrkB表达的影响[D].安徽中医药大学,2015.

[23] 李光,邢小燕,张美双,等.基于表观遗传学调控的中医药防治心肌缺血再灌注损伤的研究进展[J].药学学报, 2016,51(7):1047-1053.

[24] 王思颖.通心络对大鼠心肌梗死缺血区微血管新生及纤维化的作用机制研究[D].北京中医药大学,2016.

[25] 杜建奎.MicroRNA-22加重心肌缺血-再灌注损伤的作用及其机制研究[D].第二军医大学,2016.

Effect of “Secondary-primary Point Combination” Electroacupuncture on Cardiac Function and Apoptosis Index in a Rat Model of Myocardial Ischemia

150040,

To investigate the efficacy of “secondary-primary point combination” electroacupuncture by observing its effect on cardiac function and apoptosis index in myocardial ischemia rat to explore the mechanism by which acupuncture pretreatment protects cardiac muscles and provide a scientific method for clinical treatment of this disease.Forty rats were allocated, using a random number table, to normal, model, Neiguan and secondary-primary point combination groups. The model was made by 14 consecutive days of abdominal subcutaneous injection of isoprenaline. The normal and model groups were only grabbed and fastened and not given acupuncture. The Neiguan group received acupuncture at bilateral points Neiguan(PC6) and the secondary-primary point combination group, at point Guanyuan(CV4) and bilateral points Neiguan and Zusanli(ST36). Acupuncture was given once daily, for a total of 21 days. Left ventricular end-diastolic diameter (LVEDd), Left ventricular end-systolic diameter (LVESD), left ventricular ejection fraction (EF) and left ventricular fractional shortening (FS) were measured by echocardiography in the rats at day 22. Rat myocardial apoptosis index (AI) was determined by TUNEL.Cardiac LVEDd and LVESD were larger and EF and FS were lower in the model group than in the normal group (all＜0.01). LVEDd and LVESD were smaller in the Neiguan and secondary-primary point combination groups than in the model group (＜0.01) and smaller in the secondary-primary point combination group than in the Neiguan group (＜0.01,＜0.05), EF and FS were higher in the Neiguan and secondary-primary point combination groups than in the model group (＜0.01) and higher in the secondary-primary point combination group than in the Neiguan group (＜0.05). Rat myocardial AI was lower in the normal group than in the model group (＜0.01), lower in the Neiguan and secondary-primary point combination groups than in the model group (＜0.01) and lower in the secondary-primary point combination group than in the Neiguan group (＜0.05).Electroacupuncture can effectively alleviate compensatory cardiac dilatation and cardiac hypofunction caused by ischemic myocardial cell apoptosis and reduce myocardial cell apoptosis by decreasing LVEDd and LVESD and increasing EF and FS in a rat model of myocardial ischemia. “Secondary-primary point combination” electroacupuncture has a better effect than electroacupuncture at point Neiguan alone.

Secondary-primary point combination; Electroacupuncture; Myocardial ischemia; Cardiac function; Apoptosis index; Rats

R2-03

A

1005-0957(2018)04-0461-05

赵钢(1958—),男,教授,Email:174625809@qq.com

马莹莹(1993—),女,2017级硕士生,Email:174625809@qq.com

付嘉明(1990—),男,2014级硕士生,Email:174625809@qq.com

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.04.0461

2017-10-20