鹅沙门菌的分离与鉴定

王鹏明, 蒋增海, 宋 浩

(1.河南省农业科学院基地管理中心, 河南 郑州450000 ;2.河南牧业经济学院动物医学院, 河南 郑州450046)

沙门菌是一种革兰阴性菌,在自然界广泛分布,同时也存在于人和其他动物肠道内,是重要的人兽共患病病原之一。 家禽是沙门菌的重要宿主。沙门菌不仅可以感染家禽,引起发病或死亡,造成巨大经济损失,同时也可以造成禽肉、禽蛋等禽产品污染,引起食品安全问题,威胁人类健康。

有研究表明,鼠伤寒沙门菌在鹅场中的感染比鸭场更普遍,日龄越小感染越严重。 雏鹅感染沙门菌的死亡率比较高, 两周龄以内的雏鹅致死率可达15%以上,严重时可达80%,耐过雏鹅生长发育减缓、间接降低其商品价值,常常给养鹅户带来较大经济损失,严重影响着我国养鹅业的发展[1]。

近年来,全国各地鹅沙门菌病的发生多有报道。 俞燕等[2]报道从发病雏鹅体内分离到鼠伤寒沙门菌与印第安纳沙门菌2 种血清型混合感染,其中鼠伤寒沙门菌耐3 种药物,印第安纳沙门菌耐12种药物。 许英明[3]报道,雏鹅沙门菌与大肠杆菌混合感染,药敏试验表明,对沙门菌敏感较多如头孢噻呋、氟苯尼考、土霉素和磺胺二甲嘧啶,对大肠杆菌敏感药物有丁胺卡那霉素、先锋V 和复方新诺明等。 金海林[4]报道吉林某地一养鹅户,养鹅1 000只,发病100 只,死亡20 多只,通过临床症状和实验室诊断为沙门菌感染。 为了确定2017 年6 月豫南地区某养鹅场雏鹅发病死亡的原因,同时为该病的诊断与防治提供参考依据,而开展本次试验。

1 发病情况、临床症状和剖检变化

2017 年6 月,豫南地区某养殖场,饲养雏鹅5 000 只,网上饲养,同时结合地面自由放养,其目的是让这些雏鹅能够吃掉该养鹅场林地内的野草,从1 周龄左右开始发病,表现为采食下降,精神不振,不愿走动,排出白色稀粪,消瘦,脱水,每天死亡雏鹅约50 ～150 只,持续时间达1 周以上,发病期间,连续几天阴雨天气,偶尔晴天,一旦下雨,放牧后雏鹅死亡率陡增,使用氟苯尼考、土霉素等治疗,效果不理想;剖检病变为心包膜增厚,心包与心外膜粘连,表明覆盖纤维素性物质,心包液增多,心外膜出血;肝脏表面灰黄色坏死灶,被膜增厚(见中插彩版图1);气囊增厚(中插彩版图2),表面纤维素性物质覆盖;肠道黏膜出血,输尿管充满白色尿酸盐,肾脏肿大、出血,表明覆盖尿酸盐,呈花斑肾。 经过临床症状和病理变化,初步诊断为鹅沙门菌感染。

2 细菌分离培养

采集典型病例的心血和肝脏,分别接种于血琼脂平板,37 ℃恒温箱,培养24 ～48 h,进一步纯化传代2 ～3 次后,接种S. S. 琼脂平板,进一步培养。 在血琼脂平板生长为无色半透明、圆形、边缘整齐、湿润的大小约为1 ～2 mm 菌落,菌台生长为奶油状;s. s 琼脂平板,呈半透明、圆形、光滑、中央为黑色菌落(见中插彩版图3)。 将分离菌株命名为Yanlin2。

3 染色、镜检

挑取分离纯化的菌落,革兰染色,显微镜下观察到分离菌株为革兰阴性、短杆状、中等大小(见中插彩版图4)。

4 生化试验

生化试验使用生化微量管,按照生产厂家说明书进行。 该分离菌株的生化试验结果表明吲哚试验、V-P 试验为阴性,M. R. 试验为阳性,丙二酸盐利用为阴性,OPNG 试验为阴性,卫矛醇试验为阳性,尿素酶为阴性,KCN 为阴性,H2S 试验为阳性,赖氨酸脱羧阳性,葡萄糖产酸产气,D-甘露醇、D-山梨醇为阳性,乳酸发酵为阴性,符合沙门菌生化特征,因此鉴定为沙门菌。

5 PCR 检测

用煮沸法提取分离菌株DNA,作为PCR 扩增反应模板。 按照参考文献[6]合成1 对沙门菌检测特异性引物,上游引物Sal1： 5′-CAGGATACCTATAGTGCTGC-3′,下游 引物Sal2：5′-CGCACCGTCAAAGGAACCGT-3。 PCR 体系为25 μL,扩增程序为94 ℃4 min;94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s,35 个循环;72 ℃10min;4 ℃保存。 扩增产物,经1%凝胶电泳检测,分离菌株与预期条带580 bp 左右一致,即为沙门菌阳性。

图5 分离菌株PCR 产物电泳结果

6 血清型鉴定

采用宁波天润沙门菌属诊断血清,通过玻片凝集法对沙门菌进行血清型鉴定,以生理盐水为阴性对照,具体操作按照说明书进行,最后根据Kauffmann-White 抗原表检索沙门菌分离株的血清型,确定其具体血清型。 血清型鉴定结果表明,分离菌株沙门菌属于B 群,为鼠伤寒沙门菌。

7 药敏试验

采取纸片扩散法进行药敏试验,以E. coli(ATCC25922)为质控菌株,参照文献[7]进行药敏结果判定。 如表1 所示,药敏试验结果表明,该分离菌株对磺胺异噁唑、阿莫西林、氨苄西林、氯霉素、四环素均耐药,呈多重耐药;对美罗培南、庆大霉素、恩诺沙星、卡那霉素和多黏菌素B 敏感。

8 治疗与建议

根据流行病学、临床症状和病理变化,结合实验室检验,本次病例诊断一起典型的鹅沙门菌病,由于连续下雨天气,空气潮湿,温度变化较大,加上雏鹅放养,带菌鹅或者病鹅排出病菌,污染土壤或者泥土里污水,被健康鹅饮用后,可能导致沙门菌感染而发病。 药敏试验表明,对氯霉素、四环素、磺胺类药物、氨苄西林和阿莫西林等均耐药;对恩诺沙星(喹诺酮类药物)、庆大霉素(氨基糖甙类药物)等敏感。 我们建议养殖户选择安普霉素和环丙沙星联合用药,将药物兑水中饮用,连用3 ～5 d;同时,禁止雏鹅放养,圈舍内冲洗,严格消毒。 1 周以后,基本没有雏鹅死亡,疫情得到控制。 因此,雏鹅患沙门菌病后,采集病料、分离细菌,进行药敏试验,筛选敏感药物用于临床治疗,对控制该病十分重要。

表1 药敏试验结果

沙门菌在自然界中十分普遍,是一种条件致病菌,甚至健康鹅的消化道、呼吸道中,都存在有本菌,当营养不良、气候突变、饲料更换、鹅舍潮湿、连续阴雨天气、长途运输、受凉和发生其他疾病等因素,机体抵抗力下降时这些病菌迅速繁殖,侵入机体引起发病。 养鹅农户应该引起重视,特别是雏鹅阶段。 因此,加强饲养管理是防治本病的有效方法。