玻璃体蛋白质组学在眼部疾病研究中的应用

潘 麟 ，吴 爽 ，李 聪 ，李亚男 ，蒋 静，周占宇

(1. 大连医科大学 研究生院，辽宁 大连 116011；2.青岛市市立医院 眼科中心,山东 青岛 266000)

1 玻璃体中的蛋白质

在玻璃体中存在几种低分子量溶质，包括无机盐、葡萄糖、乳酸盐、抗坏血酸盐、溶解的脂质和蛋白质。蛋白质的平均总浓度在健康人玻璃体中为1200 μg/mL，据报道玻璃体中最普遍存在的是白蛋白和免疫球蛋白(约占蛋白质的约80%)[1]。

玻璃体中蛋白质组成对眼睛的健康和功能至关重要，其内容物的变化与眼部疾病有着极其重要的关系。已经发现玻璃体中存在丰富的细胞内蛋白质如晶状体蛋白和代谢中间体，而前者被提出可能是某些视网膜疾病的生物标志物[2]。在最近的一项研究中，Murthy等[3]确定了1205个蛋白质，其中682个尚未被描述过。按照分子功能分类将蛋白质分为：27%具有催化活性，10%具有结构活性，10%具有结合活性，4%具有细胞活性和4%具有转运蛋白活性。生物过程的进一步分类指出28%的蛋白质参与新陈代谢，20%存在细胞传递中，13%参与细胞生长。

2 蛋白质组学在眼部疾病研究中的应用

2.1 糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)

DR是糖尿病最常见并发症之一，也是成年人致盲的主要原因之一。病史长达20年的糖尿病患者中几乎所有1型糖尿病患者、80%需要胰岛素治疗的2型糖尿病患者和50%不需要胰岛素治疗的2型糖尿病患者都具有一定程度的DR[4]。基于临床研究发现，DR分为轻度、中度、重度非增殖性糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)[5]。PDR是严重威胁视力的阶段，其特征在于视网膜新生血管的生成。DR后的血管渗漏可能导致糖尿病性黄斑水肿，如果不治疗，会是一种威胁视力的并发症[5]。糖尿病性黄斑水肿可能发生在DR的任何阶段，但主要发生在疾病的晚期阶段[4]。

2.1.1 非增殖性糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)

现已使用各种材料(包括泪液，房水和玻璃体)研究了NPDR的蛋白质组。Kim等[6]对NPDR患者和健康志愿者进行了关于泪液的蛋白质组学研究，发现与健康对照组相比，没有视网膜病变和NPDR的糖尿病患者中β-2微球蛋白上调，脂质运载蛋白-1和热休克蛋白27下调。 NPDR患者的倍数变化明显。Chiang等[7]发现DR患者房水样本中血清转铁蛋白和载脂蛋白A-I水平升高，而podocan蛋白水平降低。Kim等[8]将PDR和NPDR患者的玻璃体样品，与黄斑裂孔患者的玻璃体样品进行了比较，PDR与黄斑裂孔和NPDR与黄斑裂孔患者样本相比，甲状腺素结合球蛋白、卡列司他、肝细胞生长因子激活剂、血管性血友病因子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶均增加。研究还发现，γ-谷氨酰水解酶被发现在PDR中与黄斑裂孔患者样本相比增加，但在NPDR降低。进行血浆样品分析，发现PDR与黄斑裂孔患者无差异。然而，与黄斑裂孔的患者相比，NPDR患者的血浆中甲状腺素结合球蛋白增加。蛋白质印迹分析显示，与对照组和没有视网膜病变的糖尿病患者相比，NPDR中血浆甲状腺素结合球蛋白显著增加。

2.1.2 增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)

Loukovaara等[9]从PDR和NPDR患者收集玻璃体样品总量138个。通过将PDR患者的玻璃体样品与NPDR患者的玻璃体样品进行比较，发现细胞外基质蛋白多糖分子和角膜蛋白的上调与PDR的早期无关。作者假设，它们可能介导由PDR引起的炎症反应中趋化因子的聚集。作者还发现了涉及氧化应激和活性氧的蛋白质的上调，包括过氧氧化还原酶2、过氧化物还原酶6、反应物种调节剂1和邻苯二酚1,2-双加氧酶蛋白。此外，PDR样品中上调了缺氧上调蛋白-1和一氧化氮合成酶。

在PDR患者的玻璃体样品中，Wang等[2]鉴定了血管生成素相关蛋白6和雌激素受体α的上调，其参与了PDR的新生血管生成和血管通透性增加。Gao等[10]通过比较PDR患者与无视网膜病变的糖尿病患者和非糖尿病患者的玻璃体样本，发现在PDR患者中血管紧张素原上调。与没有视网膜病变的糖尿病患者相比，PDR降低的蛋白质包括神经丝氨酸蛋白酶抑制剂、间接受体类视黄醇结合蛋白、细胞外超氧化物歧化酶、光感受器基质蛋白多糖2和钙调蛋白1。

蛋白质组学研究通常不关注DR的糖尿病类型。然而Simó等[11]将1型糖尿病患者的PDR玻璃体样品，与来自黄斑裂孔患者的玻璃体样品进行了比较，发现PDR患者的玻璃体中载脂蛋白A-I和载脂蛋白H水平升高。

Gao等[12]研究比较了PDR患者、无视网膜病变的糖尿病患者和非糖尿病患者的玻璃体样品的蛋白质组。研究显示与非糖尿病患者相比，PDR患者和没有视网膜病变的糖尿病患者的玻璃体样品中玻璃体碳酸酐酶I显著上调。随后通过将纯化的人碳酸酐酶I注射到大鼠玻璃体中，导致视网膜血管通透性增加。碳酸酐酶I对视网膜血管通透性的影响通过共同注射乙酰唑胺或甲草唑胺而被广泛抑制，两者都抑制碳酸酐酶I。因此，蛋白质组学技术将碳酸酐酶I鉴定为在糖尿病性视网膜病变中引起视网膜血管通透性增加的蛋白质。然而，碳酸酐酶抑制剂I用于治疗PDR的潜力仍有待评估。

2.2 糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)

DME是糖尿病视网膜病变患者视力丧失的主要原因[13]，可能需要进行几次玻璃体内注射抗VEGF药物和密切随访，才能获得较稳定的预后视力[14]。因此，用蛋白质组学技术鉴定潜在的药物靶点是非常重要的。Hernándezet等[15]研究了与DME有关的玻璃体蛋白质组变化。研究人员鉴定出与患有PDR和黄斑裂孔的患者相比，DME患者的4种玻璃体蛋白质有显著不同：玻璃体血红蛋白在DME中显著上调，β-晶状体蛋白S、聚集蛋白和转甲状腺素蛋白显著下调。该研究还通过将PDR患者的玻璃体样品与患有黄斑裂孔的玻璃体样品进行比较，鉴定了与PDR相关的蛋白质。在PDR中显著增加的蛋白质包括载脂蛋白H、凝溶胶蛋白和维生素D结合蛋白。 PDR中含量较低的蛋白质包括互补离体类视黄醇结合蛋白，金属蛋白酶抑制剂2和前列腺素-H2d-异构酶。

Cehofski等[16]分析来自同时患有NPDR和DME患者的玻璃体与视网膜脱离患者的玻璃体样本比较，前者玻璃体中显著增加的蛋白质包括α1-B-糖蛋白、补体成分C3、纤维蛋白原γ链和维甲酰胺D-结合蛋白。补体成分C3比对照组上调52倍。在DR发生发展过程中很少关注到补体的激活[17]，但是蛋白质组学研究清楚地表明补体激活在DR的发病机制中具有重要作用。

2.3 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)

PVR是孔源性视网膜脱离(rhegmatogenous retinal detachment,RRD)发生后的主要并发症。PVR可以被设想为伤口愈合过程中的失败产物，在损伤修复过程中，视网膜和玻璃体的细胞发生增生、迁移，形成增殖膜附着于视网膜并产生牵拉作用导致视网膜脱离，其中收缩性畸形与视力预后有关[18]。Shitama等[19]是第一个使用蛋白组学的方法来研究这类疾病的，据报道一些蛋白质在NPDR和PDR的表达中是下调的，但更显著的是在RRD和PVR中唯一表达了组织蛋白酶D，因此被提出作为这些疾病的生物标志物。组织蛋白酶D是一种蛋白质，在蛋白质降解和视紫红质蛋白水解作用中起重要作用[20]，因此在视网膜发生的病理学过程中起重要作用。Chen等[21]报道补体C4b和转甲状腺素蛋白在PVR样本中过表达，提出了这些蛋白质水平升高与疾病之间的联系。Yu等[22-24]是通过玻璃体蛋白质组学对PVR研究最广泛的组织，他们通过一系列实验来研究这类疾病。在第1项研究中他们报道了PVR玻璃体样品(特别是涉及糖酵解的酶)中未检出变化显着的蛋白质。在玻璃体和相应的血清样品中特异性检测到激肽原1，被建议为PVR的候选生物标志物[22]。在第2项研究中，将炎症作为PVR中涉及的重要环节，其中补体和凝血级联代表必不可少的途径。作者提出p53和转录因子E2F1作为PVR成功治疗RRD的新靶点[23]。最后，作者已经确认了在PVR患者的玻璃体和血清样品中特异性检测到胰岛素样生长因子结合蛋白6和激肽原1，提出它们作为该疾病的候选血清生物标志物，以及将可能的激肽原和激肽释放酶作为PVR治疗中有效的药物靶点[24]。

2.4 年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)

AMD是全球老年人失明的主要原因[25]。AMD可以进一步细分为干性AMD和新生血管性AMD(也称为湿性AMD)。干性AMD的早期阶段的特征在于玻璃膜疣的存在，其是沉积于RPE脉络膜界面处的玻璃膜疣[26-27]。黄斑区玻璃膜疣广泛存在的干性AMD患者是可以发展为新生血管性AMD的主要风险[28]。如果不治疗，新生血管性AMD通常会导致严重的视力丧失[29]。

2.4.1 干性年龄相关性黄斑变性(dry age-related macular degeneration)

Crabb等[30]研究了18只正常眼和5只AMD患眼。分离玻璃膜疣发现组织金属蛋白酶抑制剂3、聚集蛋白、玻连蛋白和血清白蛋白似乎在没有AMD患者的玻璃膜疣中很常见，而AMD患者的玻璃膜疣中更频繁地鉴定出晶状体蛋白。这些晶状体蛋白包括α-晶状蛋白B、β-晶状蛋白B1、β-晶状蛋白A3、β-晶状蛋白A4、β-晶状蛋白B2和β晶状蛋白S。此外，研究发现，通过Western印迹鉴定的羧乙基吡咯免疫反应性在AMD患者的玻璃膜疣中比在正常供体眼中更频繁，表明氧化修饰蛋白在AMD的发病机制中具有关键作用。

2.4.2 新生血管性年龄相关性黄斑变性(neovascular age-related macular degeneration)

Koss等[31]分析了来自具有初始治疗新生血管性AMD患者的73个玻璃体样品，与特发性玻璃体混浊患者的15个玻璃体样品进行了比较。新生血管性AMD中大部分显著上调的蛋白质是血浆蛋白。该研究确定了视黄醇结合蛋白3、谷胱甘肽过氧化物酶3在新生血管性AMD患者的玻璃体样品中的上调，这被认为表明新生血管性AMD的氧化应激。Nobl等[32]分析了来自新生血管性AMD患者的108个玻璃体样品，与特发性玻璃体混浊患者的24个玻璃体样品进行了比较。在新生血管性AMD患者的玻璃体样品中，研究人员确定了丛生蛋白、色素上皮细胞衍生因子和前列腺素H2-D异构酶的上调，而在新生血管性AMD中发现视神经胶质细胞被下调。Yuan等[33]研究了不同阶段AMD患者的脉络膜/Bruch膜复合物的蛋白质组学变化。在与新生血管性AMD患者的脉络膜/ Bruch膜复合物中，研究发现中性粒细胞α-防御素1-3、玻连蛋白、胶原α-1链、纤维蛋白原β链、补体C3和成神经细胞分化相关蛋白AHNAK的水平升高。此外，与干性AMD患者相比，膜联蛋白A4和补体C9在新生血管性AMD患者的Bruch膜/脉络膜复合物中更丰富。蛋白质组学研究支持补体激活在AMD发病机制中具有重要作用的假说。在目前阶段，补体抑制剂正在测试用于治疗AMD[17]。

3 展 望

玻璃体蛋白质组学方法已经将一些蛋白质作为眼部疾病治疗的潜在靶点，为识别具有治疗价值的新生物标志物提供重要的依据。从以往研究看只有有限数量的研究应用定量技术，然而这种方法应该包含更多的和更准确的定量设置且不应该停止于鉴定蛋白质生物标志物，还应包括生物标志物相互作用的蛋白质伴侣和蛋白途径的研究，关注其功能特征与疾病的病理生理过程、诊断和治疗的联系。

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