兔病毒性出血症蜂胶灭活疫苗的研制

吕远蓉 王怀禹 魏 玲 南充职业技术学院 637000

兔病毒性出血症 （Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种急性、烈性传染病，该病传播快、病死率高，可给兔场造成灾难性打击，是目前危害养兔业的主要疫病之一[1]。蜂胶是由蜜蜂采集的植物树脂与其自身的消化腺等的分泌物混合而形成的一种胶黏性固体物，具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤、促进组织再生、抑制过氧化物生成等广泛的药理活性及保健功能，将其作为疫苗佐剂既能增强体液免疫能力，又可促进细胞免疫能力，可有效提高疫苗的免疫效果[2]。本研究将蜂胶作为疫苗佐剂，制备了RHDV灭活疫苗，并分析了其免疫效果，以期为RHD新型疫苗的研制开发和推广应用奠定基础。

1 材料和方法

（1）毒株、试验动物、蜂胶。兔病毒性出血症病毒（组织毒）由南充职业技术学院种畜场实验室分离并保存；2月龄健康新西兰白兔购自黎明种兔场；蜂胶购自山东绿都安特动物药业有限公司。

（2）活抗原的制备与检验。将RHDV与10倍体积灭菌生理盐水捣碎后，颈部皮下注射易感兔，1mL/只，无菌采集接种后24～96小时内死亡兔的肝脏，将其与5倍体积灭菌生理盐水充分捣碎，-70℃下保存。将制备的RHDV抗原用灭菌生理盐水依次进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 和 10-6 10 倍倍比稀释， 取各稀释度颈部皮下注射易感兔5只，根据Reed-Muench法计算抗原对家兔的半数致死量（LD50）。

（3）灭活抗原的制备与检验。取制备的RHDV抗原2000mL，加入甲醛溶液8mL，即甲醛终浓度为0.4%，密封后，37℃下作用48小时，4℃下保存。效价测定。测定灭活抗原对人“O”型红细胞的凝集效价。无菌检验。按《中华人民共和国兽药典》三部二○一五年版附录3306进行，应无菌生长。灭活检验。取灭活抗原皮下注射易感兔5只，4mL/只，观察10天，应全部健活。

（4）蜂胶灭活疫苗的制备与检验。将蜂胶碾碎后与10倍体积无水乙醇混合，搅拌溶解后静置，上层澄清透明的栗色溶液即为蜂胶乙醇提取液。将RHDV灭活抗原与蜂胶乙醇提取液等体积混合，高速乳化，无菌分装，20mL/瓶，4℃下保存。物理性状检验，应为黄褐色均匀混悬液，静置后底部有少量沉淀。无菌检验，按《中华人民共和国兽药典》三部二0一五年版附录3306进行，应无菌生长。安全检验，取灭活疫苗皮下注射易感兔4只，4mL/只，观察10天，应全部健活。

（5）疫苗最适免疫剂量的确定。给20只易感兔分别注射疫苗0mL、0.25mL、0.5mL和1.0mL，免疫后14天，各组兔皮下注射1000 LD50的RHDV活抗原，观察7天。

（6）疫苗免疫保护期的确定。取灭活疫苗皮下注射易感兔 40 只，0.5mL/只， 分别在免疫后 3、5、7、14、30、60、120和 180天随机取 5只兔皮下注射 1000 LD50的RHDV活抗原，根据攻毒兔的死亡情况判断疫苗的免疫保护期。

（7）疫苗保存期的确定。将疫苗在4℃下分别保存3、6、9、12和18个月后， 分别注射易感兔 5只，0.5mL/只免疫后14天，各组兔皮下注射1000 LD50的RHDV活抗原，根据攻毒兔的死亡情况判断疫苗的保存期。

2 结果与分析

（1）活抗原的检验。根据Reed-Muench法测定活抗原对家兔的LD50为10-5.17/mL。

（2）灭活抗原的检验。灭活抗原对人“O”型红细胞的凝集效价为1∶1024，无菌检验合格，灭活检验合格。

（3）灭活疫苗的检验。物理性状检验合格，无菌检验合格，安全检验合格。

（4）最适免疫剂量的确定。如表1所示，疫苗免疫0.25mL可提供80%的保护率，免疫0.5mL可提供100%的保护率，确定疫苗的最适免疫剂量为0.5mL。

（5）疫苗免疫保护期的确定。疫苗免疫后3天可提供40%的保护率，免疫后5天可提供80%的保护率，免疫后7天可提供100%的保护率，至疫苗免疫后180天仍可提供100%的保护率。

（6）疫苗保存期的确定。如表3所示，疫苗在4℃下保存18个月后，保护率仍为100%。

3 讨论

随着我国绿色、环保、健康养殖理念的普及，安全环保、抗体产生快、免疫保护期长等指标逐步成为新型动物疫苗的研究方向。本研究以自行分离的RHDV毒株为疫苗毒种，以蜂胶作为疫苗佐剂，成功制成RHD蜂胶灭活疫苗。试验结果表明，该疫苗对家兔的刺激小，无不良反应，具有良好的安全性。疫苗以0.5mL/只的剂量免疫后7天即可提供100%的保护率，且至疫苗免疫后180天仍可提供100%的保护率，具有抗体产生快，持续期长等优点。分析该疫苗抗体起效快、免疫期持久的原因，可能为蜂胶颗粒与裸露游离的病毒粒子相互交联形成类免疫刺激复合物的特殊结构，接种于机体后该特殊结构可迅速刺激机体产生免疫应答反应，并具有抗原“仓库”作用，刺激机体一直产生高水平的免疫抗体。总之，以蜂胶作为佐剂的RHDV灭活疫苗抗体产生快、免疫保护期长、疫苗保存期长，是一种值得推广的新型RHD疫苗。

参考文献:

[1]李岳余，张立颖.兔病毒性出血症的防治[J].中国动物保健，2016，18（3）：27-28.

[2]王凯，何天骏，胡福良.蜂胶佐剂在兽用疫苗中的应用[J].动物医学进展，2013，34（10）：111-115.