肺腺癌循环肿瘤细胞的单细胞EGFR基因突变的检测及其临床意义

2018-04-12董一鸣

大医生 2018年8期

董一鸣

（潍坊市人民医院，山东潍坊 261041）

目前，肺癌患者的数量持续增加，肺癌死亡的人数也在逐年攀升，已成为我国目前发病率和死亡率最高的疾病之一，严重地威胁了我国居民的健康和生命。在肺癌患者当中，非小细胞肺癌（NSCLC）比例70%～80%，现有的研究发现，在这些细胞当中，NSCLC的变异率十分高，加快了癌细胞的转移和扩散。因此，对NSCLC进行基因突变检测具有很强的现实意义，能够对肺癌患者的治疗起到很大的作用。与传统的EGFR基因检测相比，这种被称为“液体活检”的新型检测技术，能够最大限度的排除外界环境的干扰，减少外界细菌的侵入等等，能够使得检测结果更加的准确，而且能够进行多次重复的利用，由于新型检测方法的优越性，受到了医学界人士的广泛借鉴与运用[1]。

1 循环肿瘤癌细胞与肺腺癌的关系

1.1 CTCs可以用于癌症早期判断

肿瘤细胞是随着时间的推迟，不断扩散和增多。在时间的推移当中，一部分细胞的上皮组织出现了变异和转化。这时，肿瘤细胞运动能力就会增强，吸附能力就会减弱，肿瘤细胞的攻击性会逐渐增强，向身体其他部位扩散。进入血循环的CTCs具有较强的异质性，会受到自身免疫系统的攻击，仅有少部分的细胞可以存活。因此，如果在患者的其他血液当中进行检测到了CTCs细胞，就可以初步对肺癌进行诊断。因此，对于CTCs的单细胞的EGFR基因突变检测，能够及时发现肺癌患者，在早期进行治疗，减少死亡率。

1.2 CTCs与肺癌分期的关系

目前，在临床上采用的肺癌的划分标准是依据美国的癌症联合委员会提出的TNM分期系统。美国的癌症委员会的分期主要依据的是手术中的所见和影像学的检测。但是，对于已经进入晚期的肺癌患者，单纯的影像技术已经不能准确的反映癌细胞在患者体内的扩散情况，因为在长期的细胞变异过程中，癌细胞的表现形式并不单一。有研究表明，肺癌的CTCs和肺癌的分期具有很大的关联性。在研究的过程当中，研究人员还选取了177名身体健康的志愿者进行相关的检测，然后对CTCs细胞进行EGFR基因突变检测。最终检测的结果显示，手术分期pT1/pT2，pT3，pT4患者CTCs检测阳性率分别是5.6%、11.3%、83%，组间比较差异有统计学意义（P=0.001）。临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者CTCs阳性率分别是15.4%、29.7%、47.9%、75.0%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）。这些研究的结果和数据都说明了CTCS和癌症分期的关联性，因此，我们在对肺腺癌循环肿瘤细胞的单细胞EGFR基因突变进行检测时，能够初步判断该患者患病的时间和治愈的可能性，并且可以根据癌症的分期，来选取最适当的治疗方法，使得患者能够得到最好的治疗[2]。

2 肺腺癌循环肿瘤细胞的单细胞EGFR基因突变检测的步骤

2.1 选取实验的材料

本次试验，我们向中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提出了申请，提取了研究院的3种非小细胞肺癌，它们的型号分别是AS49、NCI-H1650和NCI-H1975，之所以选取研究院的材料，主要是由于研究院在进行细胞的培养时，选用的是90% RPM1-1640培养基，并且添加了10%的优质血清，使得细胞更加的纯净，能够使得研究检测的数据更加的准确。这3种细胞各有各的特点，AS49主要携带的病菌是KRAS，但是KRAS与EGFR之间互相排斥，不能共融，所以，在进行基因突变的检测过程当中，可以将KRAS作为阴性对照，而NC1-H1650携带EGFR外显子19缺失突变，C1-H1975携带外显子20（T790M）和21（L858R ）双突变。

2.2 循环肿瘤细胞的捕获方法及释放

在进行本次试验时，我们对于循环肿瘤细胞的捕获主要是采用微流控系统将血液当中的CTCs与其它细胞分离出来，这种分离技术高效并且分离的细胞非常干净。在运用微流控系统对CTCs进行捕获的时候，要用UV光线对细胞进行照射，因为光线的照射可以对多聚和稀酸当中的光敏基因进行切割，从而使得CTCs能够得到彻底的释放。单细胞由于其体积十分小，在进行试验操作的过程当中，十分容易丢失，这时就需要将捕捉到的CTCs细胞固定在试剂盒内，在进行显微镜观察时，选用微型操作台，在进行CTCs细胞的取用时，可以利用毛细玻璃管的负压作用进行吸取，在转移的过程也要注意防止细胞的掉落和混乱。在观察完成之后，可以进行拍照记录，然后将细胞快速的放回试剂盒当中。

3 EGFR基因突变的特征及检测方法

3.1 EGFR的基因突变的生物特征

EGFR（epidermal growth factor receptor）是表皮生长因子受体的组成部分之一，主要用于肺癌患者的检验。EGFR的突变主要表现在细胞内的18-21的外显子上，异常的EGFR突变会导致肿瘤细胞的扩散、繁殖和分化。EGFR导致癌症主要是通过3种形式，分别是EGFR的扩散、EGFR的活化和EGFR的配体过程。EGFR的检测是目前在医学界普遍被接受的一种肿瘤靶向治疗分子，与传统的癌症治疗方法相比，EGFR基因突变检测的方法能够使得患者得到更加准确、及时的治疗。

3.2 EGFR基因突变的检测方法

EGFR基因突变检测的方法主要分为3种：测序法、聚合酶链式反应－单链构象多态性分析法和突变体富集检测法。DNA的测序法是目前用于EGFR基因突变检测最可靠和运用范围最广的一种方法。但是这种方法耗时长、费用高和技术要求高，在国内的专业的检测机构较少。所以在进行EGFR基因突变检测时，往往是根据癌症分期，来选用不同的检测方法。

4 单细胞EGFR基因突变检测对于临床的意义

4.1 提高检测结果的准确性

由于目前科技水平的限制，对于癌症的治疗效果的判断只能依靠影像学的技术，根据治疗的情况，也将治疗效果划分为了4个等级：完全缓解、部分缓解、稳定、病情进展。但是影像学的局限性十分明显，只能显示宏观的变化，例如细胞的运动和扩散情况，患者的身体变化等等，但是对于微细胞的转移却不能反映。这时，就不得不发明一种新的检测方法，使得一切细胞的转移和扩散都在检测范围之下。研究显示，肺腺癌循环肿瘤细胞的单细胞EGFR基因突变检测结果对于肺癌患者的治疗情况仍然具有很强的参考意义[3-5]。对CTCs细胞的数量、分布情况和转移趋势等方面的研究，可以实现对患者总体身体状况的判断，也可以更加准确的知道癌细胞在患者体内的具体情况。而且和传统的检测方法比较，对CTCs细胞进行EGFR基因检测的方式，不仅可以使得检测结果更加准确，还使得检测更加简便高效。

4.2 保证治疗时间的及时性

对于肺腺癌循环肿瘤细胞的EGFR的基因检测，可以对肺腺癌的情况做到精准的判断。通过对于肿瘤细胞数量和分布情况和增长速度的限制等等，可以对患者的病情做出断定，然后依据病情，对患者进行及时准确的治疗。

4.3 减少对于患者的伤害，提高康复率

EGFR是国际上普遍被认可的一种治疗肿瘤的方法，使用范围非常的广，EGFR的治疗方法可以运用到多种领域，这种方法对于患者产生的伤害更小，与传统的治疗癌症的方法有着明显的不同，可以最大限度的减少化疗等手段给患者带来的毒副作用。更为重要的一点是，选用EGFR肿瘤靶向治疗的方法，能够在治疗的过程当中，通过对于患者体内CTCs细胞的监控，实时对患者的治疗情况进行跟进，能够减少癌症患者病情恶化的情况，而且能够在一定程度上提高肺腺癌患者的痊愈率和康复率[6]。

5 单细胞EGFR基因突变检测问题与展望

世界范围内的肺癌患者越来越多，除了吸烟造成的肺癌之外，空气质量下降、不知名气体的泄露或者二手烟的危害、化学气体的危害等等也会导致肺癌的产生。目前，肺癌的治疗效果并不明显，而且治疗的效果也比较差。所以，对肺癌的关注也逐渐增高，对肺癌治疗方法的关注度也显著提高。因此，国内外的专家学者和临床的医护人员，对于CTCs的研究也投入了大量的时间和精力，主要是由于CTCs细胞与肺癌之间有极大相关性。目前的检测手法和临床试验与治疗都存在着一些问题，例如临床的实验不足，检测的方法和手段不够准确科学，缺乏统一的标准等等[7]。相信随着科技的发展和人们重视程度的提高，对于肺腺癌循环肿瘤细胞的单细胞EGFR基因突变检测一定会更加的准确。