石榴枸杞酒发酵工艺的响应面优化分析

2018-04-12吴昊李秀秀

食品与发酵工业 2018年3期

吴昊，李秀秀

1(徐州工业职业技术学院化学工程技术学院，江苏徐州，221140)2(中国矿业大学化工工程学院，江苏徐州，221116)

本研究旨在将石榴与枸杞混合发酵，加入酵母菌,以充分利用果汁中的糖分生成酒精，并将石榴和枸杞中的营养成分溶出，充分汲取了两者的活性有效成分。此酒因石榴、枸杞本身特有的清香和发酵后和谐的酒香使其风味突出，又综合利用原料中的石榴汁和枸杞汁中固有的丰富颜色，酿制成芳香醇厚、颜色鲜亮的果酒。因此，这既能充分利用石榴枸杞的资源，增加它们的附加价值，又能促进农业经济发展，顺应了当前酒类行业的发展趋向[1-2]。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

软籽石榴：徐州贾汪；枸杞：宁夏；酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：太古糖业有限公司；果胶酶(生化级)：江苏锐阳生物科技有限公司；二氧化硫 (食品级)：法国进口。

1.2　仪器与设备

料理机，九阳股份有限公司；DZG-6090电热真空干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；HH-S8电热恒温水浴锅，常州市万合仪器制造有限公司；WYT-J手持式糖度计，杭州生物科技有限公司；酒精计，河北省武强县同辉仪表厂；BSA224S电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；GTR22-1高速冷冻离心机，北京时代北利离心机有限公司；UV-2000紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；RV10旋转蒸发器，RV 10旋转蒸发仪，艾卡(广州)仪器设备有限公司。

1.3　方法

1.3.1 石榴枸杞酒的工艺流程

1.3.2石榴汁的制作

挑选个大、无损坏的石榴，去掉外皮和内种皮，用清水清洗数次，按照V(石榴)∶V(水)=1∶1的比例加水，放入料理机进行榨汁[3]。

1.3.3枸杞汁的制作

挑选个大、果肉肥厚无霉变的枸杞果，用清水清洗数次，按照V(枸杞)∶V(水)=2.5∶1的比例加水，浸泡3 h，放入料理机进行榨汁[3]。

1.3.4石榴枸杞汁成分调配

将两种果汁按照一定比例混合200 mL放入发酵瓶中，用移液管吸取5 mL，在离心机3 600 r/min下离心10 min之后，用移液管移取上清液并测量其糖度及酸度，按每17 g/L的糖能产生1%vol酒精调整糖度，用白砂糖调整糖度，使糖度达到25%，用柠檬酸调pH在3.1～3.8之间即可[4-5]。

1.3.5混合原料预处理

将成分调配好的果汁混合液，加入一定量的SO2和果胶酶，接入活化酵母[6-9]。

1.3.6发酵工艺单因素试验

将混合原料成分调配好后，接入酵母，发酵时间为6 d，考察石榴枸杞汁比、酵母量以及发酵温度等3个因素对石榴枸杞酒酒精度的影响，探讨单因素的最佳工艺参数。

1.3.7响应面法优化发酵工艺

根据单因素实验，设计了石榴枸杞汁比、酵母量与发酵温度3个因素3个水平进行响应面法优化试验[10-13]。试验因素水平见表1。

表1　响应面试验因子水平编码表Table 1　Factors and levels of response surface experiments

1.3.8果汁理化指标和酒精度的测定

按《GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法测定果汁中的总糖、总酸、可溶性固形物等指标以及发酵酒酒精度。

1.3.9后发酵处理

前发酵结束后，将上部清液转入另一个已灭过菌的发酵瓶中，与酵母及酒脚等沉淀物分离，在16～20 ℃下发酵30 d。

1.3.10发酵酒多酚类化合物的含量测定

因石榴中含有多种多酚类活性物质，是保健酒中重要的活性成分，因此检测分析发酵酒中的多酚类化合物含量可作为保健酒质量的评判标准。本试验选择没食子酸为标准品，应用Folin-Ciocalteu比色法进行测定[17]。

1.3.11发酵酒多糖的含量测定

由于枸杞中含有枸杞多糖的活性物质，具有抗氧化性，增强人体免疫力功效，因此检测分析发酵酒中的多糖含量，可作为保健酒质量的评判标准。本试验选择以葡萄糖做标准品，用硫酸-苯酚比色法进行测定[18]。

2　结果与分析

2.1　果汁理化指标

参照国家GB/T15038—2006 标准，对石榴汁及枸杞汁的理化指标进行检测。石榴汁：总糖11%，有机酸(以柠檬酸汁)0.62%；可溶性固形物13%；枸杞汁：总糖13%，有机酸(以柠檬酸汁)0.57%，可溶性固形物15%。石榴汁和枸杞汁中含有的总糖和可溶性固形物较为丰富，适合作为原料发酵。

2.2　石榴枸杞汁比对石榴枸杞发酵酒的影响

取经处理好的石榴枸杞汁，在酵母量4%，发酵温度26 ℃，发酵时间6 d的条件下，考察不同石榴枸杞汁比对石榴枸杞发酵酒的影响(图1)。

图1　石榴枸杞汁比对石榴枸杞发酵酒的影响Fig.1　Influence of juice ration on pomegranateandmedlarfermentation wine

当石榴枸杞汁之比为2∶1(V∶V)时酒精度达到最高，可能是因为此时的石榴枸杞混合汁的渗透压较适合酿酒酵母的生长，因此酵母代谢产生酒精含量高[19]。当逐渐增加石榴汁的比例时，由于石榴汁相比较枸杞汁来说含糖量较低，因此补加的白砂糖愈多，可能对发酵过程产生消极的影响愈明显，当超过2∶1(V∶V)时酒精度呈下降趋向，这与添加白砂糖可能会影响到酵母的正常生长和代谢有关。因此，选择石榴枸杞汁比1∶1、2∶1、3∶1(V∶V)做石榴枸杞酒响应面分析以确定最佳汁液比。

2.3　酵母量对石榴枸杞发酵酒的影响

取经处理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁比为2∶1(V∶V)，发酵温度26 ℃，发酵时间6 d的条件下，考察不同酵母量对石榴枸杞发酵酒的影响(图2)。

图2　酵母量对石榴枸杞发酵酒的影响Fig.2　Influence of yeast inoculation quantity onpomegranateandmedlar fermentation wine

由图2可知，随酵母量的增加酒精度增加，糖度则相应的减少，因为酵母量越多，越有利于糖向酒精产物方向转化，但当酵母量超过3%时，酒精度反而减小，可能是因为酵母量过多，导致微生物繁殖过快而造成底物营养缺乏，微生物产生激烈的竞争，从而影响微生物生长发酵[20]。酵母量超过3%时，由于营养源不足造成发酵酒中的含糖量略微增加，因此选择酵母接种量为2%、3%、4%做石榴枸杞酒响应面分析以确定酵母最佳添加量。

2.4　发酵温度对石榴枸杞发酵酒的影响

取处理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁比为2∶1(V∶V)，酵母量4%，发酵时间6 d的条件下，考察不同发酵温度对石榴枸杞发酵酒的影响。

由图3可知，发酵温度不断升高,酒精度也不断增加，温度到达26 ℃时酒精度达到最大值，而糖度为最小值，温度超过26 ℃酒精度呈下降趋向，这是因为发酵温度对酵母菌的生长繁殖有重要的影响，温度低于26 ℃，此时没有达到酵母菌的最适生长温度，酵母菌生长繁殖较慢，随着温度的升高，酵母菌成长速度逐渐加快，26 ℃时生长繁殖最快，新陈代谢旺盛，产酒精量高。当温度超过26 ℃时，此时影响了酵母菌的生产繁殖，代谢降低，酒精度降低，所以选择温度24、26、28 ℃做石榴枸杞酒响应面分析以确定最佳发酵温度。

图3　发酵温度对石榴枸杞发酵酒的影响Fig.3　Influence of temperature on pomegranateand medlar fermentation wine

2.5　响应面法优化发酵工艺条件

2.5.1回归模型的建立及方差分析

石榴枸杞酒发酵工艺的响应面优化分析结果见表2。通过Design Expert 8.0.6软件进行实验模型的回归分析，并对石榴和枸杞酒发酵的最佳工艺参数进行预测。方差分析的结果见表3。

对表2中试验数据进行多元回归方程拟合，得到各因素水平对石榴枸杞酒酒精度(Y)影响的二次多项回归模型方程：

Y=9.53+0.044A-0.17B+0.57C-0.058AB-0.43AC+0.045BC-1.08A2-0.44B2-0.21C2

(1)

表2　Box-Behnken试验设计方案及结果Table 2　Results of Box-Behnken central composite design

表3　响应面结果的方差分析Table 3　Variance analysis of response surface methodology

2.5.2响应面分析及优化

结合公式(1)，采用Design Expert 8.0.6软件绘制响应面分析图。图4～图6直观反映了各因素间的交互作用对石榴枸杞酒酒精度的影响[22]。根据统计学规律，A、B、C各因素所对应的F值越大表明该因素对响应值的影响就越大，因此可知各因素对酒精度影响的主次顺序:最大的是发酵温度，其次是石榴枸杞汁比，最后是酵母接种量。由软件分析得最佳工艺参数：发酵温度28 ℃、石榴枸杞汁比1.87∶1(V∶V)、酵母菌接种量2.82%，此时乙醇体积分数的预测值Y 为9.935 28%(vol)。考虑实际操作性，将发酵工艺参数修正为发酵温度28 ℃、石榴枸杞汁比2∶1、酵母菌接种量3%。

图4～图6表明，石榴枸杞汁比和酵母接种量交互作用对石榴枸杞酒酒精度的影响显著度不大，而发酵温度和酵母接种量交互作用对石榴枸杞酒酒精度的影响非常明显，偏高或偏低的发酵温度以及酵母接种量都会使石榴枸杞酒酒精度降低[23]。

图5　接种量与发酵温度因素相互作用的等高线和响应面Fig.5　Contour and response for the alcoholicity under factorinoculation quantity and temperature interaction

图6　石榴枸杞汁比与发酵温度因素相互作用的等高线和响应面Fig.6　Contour and response for the alcoholicity under factorration on pomegranate-medlarjuice and temperature interaction

2.5.3验证性试验

在最优发酵条件下，石榴枸杞酒酒精含量的理论预测值为9.93%vol。为验证试验结果的可靠性，采用最佳发酵条件对石榴枸杞酒进行发酵试验，测试结果如表6所示。由表6可以看出，3 组平行试验的结果分别为9.92%vol、9.94%vol、9.95%vol，平均值为9.94%vol，RSD值仅为0.15%。因此，响应面法优化石榴枸杞酒发酵工艺参数准确、可靠、重现性好，具有一定的实用价值[24]。

表6　最佳发酵工艺试验结果Table 6　Test results of the optimum fermentation process

3　结论

通过单因素试验和中心组合设计试验，采用响应面分析法优化石榴枸杞发酵工艺条件，建立石榴枸杞酒发酵工艺的二次多项数学模型。该模型极显著，拟合情况较好，可用来预测设定条件范围内石榴枸杞酒发酵工艺参数，有一定的实用价值。各因素对石榴枸杞酒发酵工艺的影响次序为发酵温度>石榴枸杞汁比>酵母接种量，优化后工艺条件参数为发酵温度28 ℃、石榴枸杞汁比2∶1(V∶V)、酵母菌接种量3%。在此条件下，产品酒精度可达9.94%vol，发酵所得的石榴枸杞酒香纯厚，酒味突出，颜色为棕红色，有光泽，透明度高，无苦涩味。经检测，该酒符合食品安全国家标准《GB 2758—2012发酵酒及其配制酒》，酒体中含有丰富的活性物质，多酚类化合物含量200 mg/L，多糖含量达1.15 g/L，具有防治心血管疾病及增强人体免疫能力等保健功效[25]，是一种营养丰富的保健型发酵酒，开发前景广阔。

[1]王军节, 张怀予, 马光勇,等. 早酥梨果酒酿造工艺优化及其香气成分分析[J]. 食品与发酵工业, 2012, 38(3):123-127.

[2]张超, 王玉霞, 周丹红. 发酵型青梅枸杞果酒澄清技术研究[J]. 中国酿造, 2015, 34(12):149-152.

[3]杨天英,赵金海.果酒生产技术[M]. 北京：科学出版社,2009.

[4]安冬梅.影响枸杞酒品质的因素及其控制措施[J].中国酿造,2006(7):52-54.

[5]顾国贤.酿造酒工艺学 [M].北京:中国轻工业出版社,1996:399-403.

[6]顾庆才.石榴汁澄清问题的研究[J].食品科学,1998(11):64-65.

[7]邹海晏.酿酒鲜酵母与活性干酵母的比较及应用技术探讨[J].酿酒科技,1997 (2):21-23.

[8]伍明,王杰.枸杞子中红色素的提取与稳定性 [J].中国食品添剂,1997(1)：12-14.

[9]汤卫华, 曹天一, 王立晖,等. 枸杞酒枸杞酶解条件的研究[J]. 中国酿造, 2014, 33(6):103-106.

[10]李云雁,胡传荣.实验设计与数据处理[M].北京：化学工业出版社, 2005.

[11]郭晓旭, 王强, 李国莹,等. 红曲枸杞酒发酵工艺优化研究[J]. 酿酒科技, 2015(5):79-82.

[12]成周霞, 李娟, 吴昊,等. 保健型银杏枸杞酒的发酵工艺研究[J]. 酿酒, 2016, 43(4):71-75.