苯乳酸生产菌的筛选及鉴定

黄国昌，顾斌涛，黄朝，金丹凤，熊大维，黄筱萍，刘兰

(江西省科学院 微生物研究所，江西 南昌，330096)

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA，又称3-苯基乳酸)是继乳酸链球菌素(Nisin)和ε-聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)之后人们发现的一种新型生物保鲜剂，相比Nisin和ε-PL，因PLA具有更加宽广的抑菌谱，不仅能抑制多种食品致病菌，还能抑制引起食品腐败的真菌，且其溶解性好、对酸碱和热稳定性强，具有广泛应用于各种食品和果蔬保鲜的潜质，因此，近年来成为了人们研究的热点。

早在20世纪90年代，WILKINS等[1]就认为蜂蜜中的丁香酸和苯乳酸是主要的抑菌物质，但是也有人对此存在争议。直到1998年，DIEULEVEUX等[2-3]首次报道了白地霉(Geotrichumcandidum)发酵的干酪对单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)具有抑制作用，并确定苯乳酸就是主要的抑菌物质。随后，人们在苯乳酸产生菌的筛选方面做了许多研究，发现大部分的乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)都能产生苯乳酸，此外一些丙酸菌(Propionic acid bacteria, PAB)也能生产苯乳酸。LAVERMICOCCA等人[4]报道Lactobacillusplantarum21B能产生苯乳酸，STROM[5]等从青贮饲料中分离到1株L.plantarumMiLAB393，MAGNUSSON[6]从青草中分离出棒状乳杆菌(L.coryniformis)，李兴峰等[7]从泡菜中分离得到1株植物乳杆菌(L.plantarumSK007)，VALERIO[8]等分离到多种乳酸菌能够产生苯乳酸。

目前报道的苯乳酸产生菌的筛选大都采用碳酸钙溶解圈和抑菌圈的方法进行初筛，文中根据前人报道的方法进行了改进，筛选效率更高、目标更加明确，从泡菜中分离得到2株苯乳酸高产菌株，并根据16 S rDNA序列分析，初步对其进行了菌种鉴定。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1样品

市售各类酸菜、泡菜，自制泡菜，酸乳，发酵面团，青贮饲料等。

1.1.2试剂

培养基各组分购自上海生工公司，苯乳酸、苯丙氨酸标准品购自SIGMA公司，甲醇(色谱纯)、三氟乙酸(色谱纯)购自MERCK公司。

1.1.3培养基

富集培养基：MRS培养基中加入2.0 g/L的苯乳酸；

初筛1下层培养基：MRS琼脂培养基中加入2.0 g/L苯丙氨酸；

初筛1上层培养基：MRS琼脂培养基中加入30 g/L的CaCO3(单独灭菌)；

初筛2下层培养基：同初筛1下层培养基；

初筛2上层培养基：NB琼脂培养基；

保藏培养基：MRS琼脂培养基；

发酵培养基：改良MRS培养基中加入2.0 g/L苯丙氨酸。

1.1.4指示菌

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均为本研究室保藏。

1.2　方法

1.2.1苯乳酸产生菌筛选方法

取样品汁液1 mL或样品梗茎适量接入富集培养基中，30 ℃培养24 h进行菌种富集。取0.1 mL经适当稀释的菌液接入初筛1下层培养基，30 ℃培养24 h后，注入初筛1上层培养基，继续培养24 h，挑取溶钙圈大的菌落接种至初筛2下层培养基上，30 ℃培养24 h后，注入初筛2上层培养基，凝固后接入指示菌，继续培养24 h后，挑取抑菌圈大的菌落划线纯化。初筛后的菌株分别接入发酵培养基中，30 ℃兼性厌氧培养48 h后，采用高效液相色谱法(HPLC法)分析发酵液中苯乳酸的产量，挑选高产菌株进行斜面和甘油保存。

1.2.2发酵液中苯乳酸的检测方法

发酵液经10 000 r/min离心5 min和0.22 μm滤膜过滤后，采用Waters e2695 Alliance 高效液相色谱分离单元和Waters 2489 UV/Vis检测器进行分析。参考黄国昌等[9]方法，色谱柱：Waters Symmetry®C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，柱温：30 ℃，进样量：10.0 μL，流速：1.0 mL/min，流动相：A相为体积分数0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B相为体积分数0.05%三氟乙酸溶液，洗脱程序：0～20 min为A∶B由10%线性变化为100%，20～23 min为100% A相，23～25 min保持A∶B为10%，检测波长：210 nm。

1.2.3菌种初步鉴定方法

纯化后的菌株进行纯培养后，观察菌落形态和显微观察菌体形态，并提取基因组DNA后，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA测序，将测序结果与NCBI进行BLAST比对，找出与其同源性较高的菌株，并初步判定筛选菌株的种属。

2　结果与讨论

2.1　苯乳酸产生菌的筛选

富集培养过程中通过在培养基中添加2.0 g/L的苯乳酸，一方面抑制大部分非目标菌的生长，另一方面，对苯乳酸耐受性差的乳酸菌也被淘汰，大大增加了筛选的目标性，通过改进的溶钙圈法对富集菌进行第一次初筛后，50个样品中筛选出113株初筛菌。改进后溶钙圈法优点:富集后的菌液接入含有苯丙氨酸为底物的培养基中培养24 h后，再在上层注入一层含CaCO3的琼脂培养基，一方面可以减少产其他酸菌株的影响，其次，如按其他文献所述，直接将CaCO3加入培养基中，在凝固时，CaCO3沉至平皿底部，倒置培养时，因初筛得到的菌株苯乳酸产量较低，PLA很难与上部的CaCO3接触而产生溶钙圈，而本文通过双层培养基，恰好使菌落和CaCO3紧密接触，极大降低了目标菌漏筛的可能性，且对于其他微量产酸菌的筛选提供了借鉴。图1为改进方法和已有文献报道方法的比较，可明显看出，改进后的方法出现明显的溶钙圈，而在对照组中只有一个菌落出现不太显著的溶钙圈。通过第一次初筛后，溶钙圈情况如表1所示，溶钙圈直径大于0.6cm的菌株数为39个。挑取溶钙圈较大的菌落进行第二次抑菌圈筛选，如图2和表2所示，对两种指示菌抑菌圈直径均超过2.0 cm的菌株共有15株。

图1　两种溶钙圈法的比较Fig.1　Comparison of two methods of dissolving calcium rings

溶钙圈直径d/cm菌株数d≤0.2230.2≤d≦0.4360.4≤d≦0.6230.6≤d≦0.739

图2　初筛菌株对指示菌的抑制情况Fig.2　Inhibitory effect of screened strains on indicator bacteria

抑菌圈直径d/cm菌株数1≤d≦1.571.5≤d≦2.0172.0≤d≦2.515

15株初筛菌进行摇瓶发酵后，检测发酵液中的苯乳酸含量，结果如表3所示，得到2株苯乳酸产量大于300 mg/L的复筛菌株，分别命名为BLPC002和SCPC008，苯乳酸产量分别为358 mg/L和333 mg/L。从筛选的结果可以看出，本研究通过改进筛选方法后，淘汰了大部分产苯乳酸能力较弱的菌株，经改良后的溶钙圈法和抑菌圈法初筛后，筛选得到的大部分菌株苯乳酸产量都超过200 mg/L，只有2株苯乳酸产量低于100 mg/L，而目前关于苯乳酸生产菌筛选的相关报道中[7-8,10]，初筛菌摇瓶发酵苯乳酸产量都在100 mg/L以下，由此可见，改良后的筛选方法能有效提高微量产酸菌的筛选效率。

2.2　菌种的初步鉴定

2.2.1菌株的形态特征观察

培养基上的菌落形态为白色、凸起、光滑、湿润、易挑取，在显微镜下观察菌体形态为杆状，单独、成对或短链排列，如图3，从菌落形态和菌体形态上初步判断为一种乳杆菌。

表3　初筛菌摇瓶发酵结果Table 3　Results of shaking flask fermentation byscreened strains

图3　显微镜下菌体形态Fig.3　Microscopic morphology of screened strains

2.2.216S rDNA序列测定

对2号菌和8号菌纯化后，提取基因组DNA，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA测序并将测得的16S rDNA序列在NCBI核酸数据库中进行BLAST搜索，结果如表4和表5，表明2株菌株均与植物乳酸杆菌16SrDNA序列同源性高达100%，因此初步判定筛选得到的2株苯乳酸生产菌为植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)。

表4　2号菌序列比对结果Table 4　Results of sequence comparison of strain No.2

3　结论

(1)对目前通用的产酸菌筛选方法进行了改良，建立了一种准确、高效筛选微量产酸菌的方法，从自然环境中筛选得到2株苯乳酸产量大于330 mg/L的苯乳酸产生菌，分别命名为BLPC002和SCPC008；(2)对2株高产菌株进行形态学和16S rDNA序列鉴定，确定该2株苯乳酸生产菌均为植物乳酸杆菌。

表5　8号菌序列比对结果Table 5　Results of sequence comparison of strain No.8

[1]WILLKINS A,LU Y,TANS.Extractives from New Zealand honeys.4.Linalool derivatives and other components from nodding thistle(Carduusnutans) honey[J].J Agric Food Chem,1993,41(6):873-878.

[2]DIEULEVEUX V,VAN DER PYL D,CHATAUDJ,et al.Purification and characterization of anti-Listeriacompounds produced byGeotrichumcandidum[J].Appl Environ Microbiol,1998,64(2):800-803.

[3]DIEULEVEUX V,GUÉGUENM.Antimicrobial effects of D-3-phenyllactic acid onListeriamonocytogenesin TSB-YE medium,milk and cheese[J].J Food Prot,1998,61(10):1 281-1 285.

[4]LAVERMICOCCA P,VALERIO F,EVIDENTEA,et al.Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdoughLactobacillusplantarumstrain 21B[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(9):4 084-4 090.

[5]STROMK S， JOGREN J,BROBERG A,et al.LactobacillusplantarumMiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro) and cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-phenyllactic acid[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(9):4 322-4 327.

[6]MAGNUSSON J,STROM K,ROOS S,et al.Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria[J].FEMS Microbiol Lett,2003,219(1):129-135.

[7]李兴峰, 江波, 潘蓓蕾, 等. 产苯乳酸的乳酸菌分离筛选及菌种鉴定[J]. 食品与发酵工业,2007, 33(2):1-4.

[8]VALERIO F,LAVERMICOCCA P,PASCALEM,et al.Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria: an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation[J].FEMS Microbiol Lett,2004,233(2):289-295.

[9]黄国昌,熊大维,黄筱萍,等.高效液相色谱法检测发酵液中苯乳酸和苯丙氨酸含量的研究[J].江西科学, 2016 ,34 (5) :614-618,702.

[10]张莉力,柴虹宇.产苯乳酸乳酸菌的筛选及鉴定[J].安徽农业科学,2010,38(5):2 590-2 592.