骨髓间充质干细胞细胞膜片复合富血小板血浆促进种植体周围骨组织再生的研究

刘茜 周炜 刘欢 王忠山 李雪健 赵铱民

目前，提高种植体骨结合的方法主要为通过物理、化学修饰等方法进行种植体表面改性。但放疗区骨组织由于骨细胞及微血管受损而导致种植体周围骨改建和再生能力降低，仅单纯依赖种植体表面改性，得到的效果并不明显。在前期的研究中，本课题组发现将BMSCs细胞膜片包裹于种植体周围构建组织工程化的种植体可促进种植体的骨结合［1］，但单纯使用BMSCs细胞膜片而没有添加促进血管生成的因子无法在放疗区得到很好的促进骨组织再生的效果。将内皮祖细胞（EPCs）与BMSCs构建复合细胞膜片可以在促进成骨的同时促进血管的再生，包裹种植体种植于放疗区可获得较好的促进骨结合的效果［2］，但仍存在植入时膜片易脱落或膜片聚集于种植体上部而使作用范围较小等问题［3］，并且对于缺损区的形貌维持和体积支撑很有限，当种植体周围存在较大的骨组织缺损时则无法很好的实现骨组织再生，因此需要进一步研究如何优化细胞膜片的应用。富血小板血浆（PRP）含有大量促进成骨和成血管的细胞因子，近年来开始应用于骨组织再生［4］。有研究表明，使用PRP处理种植体可以提高种植体的骨结合与稳定性［5］。将BMSCs与富血小板血浆复合用于犬下颌骨种植体周围，取得较好的骨组织再生效果［6］。PRP在钙离子、凝血酶等的激活下可以形成凝胶状结构，本实验将PRP与BMSCs细胞膜片联合使用，构建可注射的复合凝胶，研究其促进种植体周围骨组织再生的可能性。

1 材料与方法

1.1 主要材料和设备

α-MEM培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、PBS缓冲液、抗坏血酸、枸橼酸钠、双抗、4%多聚甲醛固定液、戊巴比妥钠（Sigma，美国）；CO2培养箱（Thermo Forma，美国）；体式显微镜（LEICA M205FA，德国）；正置显微镜成像系统（Nicon CX J30，日本）；场发射扫描电子显微镜（S-4800，Hitachi，日本）；纯Ti种植体（Φ2 mm，长6 mm，西安有色金属研究院）；β-TCP方块（武汉华威有限公司）；小动物Micro CT（Inveon CT，Siemens AG，德国）；硬组织切片机（LEICA SP1600，德国）；6周龄BALB／c裸鼠；2周龄SD大鼠（空军军医大学动物实验中心）。

1.2 BMSCs的获取、鉴定及细胞膜片的制备

2周大SD大鼠，过量戊巴比妥钠注射处死，取股骨及胫骨，全骨髓法培养BMSCs。取第三代BMSCs用于后续实验，倒置显微镜下拍照。成骨诱导：取第三代BMSCs，当细胞生长融合约90%后，培养基更换为成骨诱导液（15%FBS，1%双抗，50μg／ml左旋抗坏血酸，10－7mol／L地塞米松，10 mmol／L b-甘油磷酸钠），进行成骨诱导培养，3周后茜素红染色。成脂诱导：取第三代BMSCs，当细胞生长融合约90%后，培养基更换为成脂诱导液（15%FBS，1%双抗，0.5 mmol／L IBMX，1μmol／L地塞米松，200μmol／L吲哚美辛，10μmol／L胰岛素），诱导2周后进行油红O染色。

细胞膜片培养：取第三代BMSCs，当细胞生长融合约80%，培养基更换为成膜诱导液（10%FBS，1%双抗，50μg／ml Vc）。培养10～14 d至膜片形成。将BMSCs细胞膜片切割为大小约为1 mm×1 mm的颗粒。取少量膜片在体式显微镜下观察并固定后做石蜡切片及HE染色。

1.3 PRP的制备

取体重300 g左右SD大鼠，1%戊巴比妥钠麻醉后固定，备皮，于第三、第四肋间将注射器刺入心脏取动脉血，按照9∶1的体积加入3.8%柠檬酸钠抗凝液混匀。1 700 r／min离心10min，取上清液，3 200 r／min离心5 min，弃3／4上清液，混匀，即可制得PRP。

1.4 BMSCs细胞膜片-PRP复合物的构建及体内移植

1.4.1 将BMSCs细胞膜片（初始细胞数量为5×106个／培养皿）切割后收集，离心，PBS清洗，加入250μl PRP及25μl凝血酶，混匀，迅速吸入注射器内。30～40 s即可凝固为凝胶状。取部分凝胶快速转移至含有4%多聚甲醛的离心管内，固定24 h后冻干、扫描电镜观察其形态结构。

取中心有圆柱形孔隙（直径3 mm，长4mm）的β-TCP小方块（5 mm×5 mm×5 mm），将种植体置入其中，分别将 BMSCs膜片-PRP复合物（BMCS＋PRP组）、单纯BMSCs细胞膜片碎片（BMCS组）、单纯PRP凝胶（PRP组）使用16G针头注射入种植体与材料之间的孔隙中。

1.4.2 取9只BALB／C裸鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，消毒双侧皮肤，剪开背部皮肤约2 cm，钝性分离皮下组织，随机将3组复合物分别植入（n＝6），缝合皮肤并消毒。

1.4.3 Micro-CT分析 饲养8周后取材，取样本于4%多聚甲醛中固定24 h后进行Micro-CT扫描（分辨率为21μm），观察种植体表面新骨形成并进行三维重建。选择灰度为8000区分种植钉和β-TCP材料，选择灰度为4000区分骨结构和β-TCP，选择灰度为1500区分骨组织与空腔。感兴趣区域为β-TCP和种植体之间的空间，计算骨体积／总体积（BV／TV）。

1.4.4 不脱钙硬组织切片及VG染色 将固定后的样品梯度酒精脱水，置入二甲苯中透明24 h，依次转入渗透液I、II、III中分别浸泡48 h，最后进行包埋、切片，切片厚度为50μm。对切片进行 VG染色后观察、拍照，采用image pro plus6.0软件分析种植体周围骨面积（BA）。计算公式为感兴趣区域内新生骨面积／总面积，感兴趣区域为种植体与β-TCP材料之间的空隙。

1.5 统计学分析

所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。实验数据采用 one-way ANOVA检验比较组间差异；若结果有差异，采用Turkey HSD检验进行两两比较，P＜0.05时认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs鉴定

BMSCs为短梭型，呈集落样生长（图1A）。成脂诱导染色可见有脂滴形成（图1B）。成骨诱导染色可见红染钙化结节形成（图1C）。诱导14 d后，可见细胞膜片形成，可揭起。将细胞膜片剪碎后，在体视显微镜下观察，可见膜片呈半透明状，大小约1 mm×1 mm（图1D）。HE染色可见细胞膜片碎片由2～3层细胞及大量细胞外基质构成，厚度30～50μm（图1E）。

2.2 BMSCs-PRP复合物的制备

BMSCs膜片颗粒与PRP、凝血酶混合后约40 s可形成淡黄色凝胶状结构（图2A）。扫描电镜下观察可见网状纤维结构的PRP与大量BMSCs细胞聚集的膜片，PRP充填于细胞膜片所构成的框架之间（图2B）。将BMSCs与PRP复合凝胶注入种植体与β-TCP间后可得种植体-BMSCs膜片-PRP复合体（图2C）。

图1 BMSCs形态与鉴定及BMSCs膜片颗粒的形态学观察（×100）Fig 1 Characterization of BMSCs and morphological observation of BMSCs sheet fragments （×100）

图2 BMSCs膜片-PRP复合物的构建Fig 2 Construction of BMSCs sheet fragments-PRP complex

2.3 Micro-CT结果

Micro-CT结果可见BMSCs＋PRP组种植体周围有较多骨质形成。而BMSCs组与PRP组种植体周围几乎无骨质形成（图3A）。BV／TV结果BMSCs＋PRP组为（0.122 9±0.055 65），BMSCs组为（0.010 82±0.008 37），PRP组为（0.014 63±0.003 44），BMSCs＋PRP组显著高于BMSCs组及PRP组，具有统计学差异（P＜0.05）。BMSCs组与PRP组无明显差异（图 3B）。

2.4 硬组织切片结果

硬组织切片经VG染色（图4A）后可见BMSCs膜片＋PRP组种植体周围有红染的新生骨形成，骨内可见骨陷窝及骨细胞。新生骨周围可见较多尚未完全矿化的类骨质，其中含有丰富的细胞核较大的成骨细胞及血管，并有新生骨伸向种植体与金属表面接触。BMSCs膜片组可见较多纤维结缔组织，未见新生骨形成。PRP组仅在种植体上部有少量纤维组织。对硬组织切片种植体周围骨面积（BA）进行分析（图 4B），BMSCs＋PRP组 BA（0.082 6±0.006 44）显著高于BMSCs组（0.009 3±0.002 99）及 PRP组（0.003 7±0.001 78）（P＜0.05）。BMSCs组与 PRP组无明显差别（P＝0.316）。

3 讨 论

在本实验中，通过将BMSCs膜片与PRP混合构建了可注射的凝胶状结构，注射于种植体周围，研究发现了使用BMSCs与PRP复合物组在种植体周围有更多的新生骨形成；证实了联合使用BMSCs膜片与PRP可以促进种植体周围骨组织再生。

图3 Micro CT观察及分析Fig 3 Micro CT observation and analysis

在本实验中，使用β-TCP材料模拟种植体植入种植窝的物理状态，以便将细胞膜片与PRP复合物置于种植体周围，并利于取材后进行不脱钙硬组织切片；术后8周可见CS＋PRP组产生了最多的新生骨；Micro-CT结果显示在CS＋PRP组中，种植体与材料的孔隙中有较多骨质形成；硬组织切片结果也验证了这一点，并且可见部分新生骨沿种植体表面生长。同时，也可观察到在红染的新生骨周围有较多蓝紫色类骨质及未完全骨化的纤维结构，表明其正在矿化。单纯BMSCs膜片组可见大量纤维结缔组织，但并未见到有矿化的胶原及血管形成，表明单纯BMSCs细胞膜片的成骨效果较差。对照组PRP组仅在种植体上部有少量纤维结缔组织，可能是由于裸鼠的粘膜上皮细胞与材料接触而形成。

图4 β-TCP／BMSCs-PRP／种植体组织学观察及检测Fig 4 Histological examinations ofβ-TCP／BMSCs-PRP／implant constructs

实验结果表明PRP在BMSCs细胞膜片成骨的过程中起到了重要的作用。PRP作为自身血液提取的富含高浓度血小板的血浆，获取较易，没有免疫原性，并且包含多种成骨相关的生长因子，包括PDGF、TGF-β1、VEGF、IGF-1等，在骨形成和愈合的初始阶段有促进作用［7］。并且可以促进细胞的增殖，基质的重建及血管再生［8］。PRP可以提高 BMSCs的ALP活性和COL-I型胶原的表达［9］。同时PRP可以提高BMSCs中VEGF表达，促进血管的生成，而丰富的血管可以为新生骨的形成带来更多的营养与氧气，新生血管也可以刺激成骨细胞及成骨细胞前体细胞的分化，从而获得更好的骨组织再生［10］。有研究将PRP与BMSCs用于促进骨质疏松模型的大鼠的骨缺损，可以获得更好的骨组织愈合和再生［11］。对于放疗区骨组织而言，放疗所造成的血管损伤是造成成骨细胞、骨髓细胞等在较长时间内数量减少及功能受损的主要原因，因此，促进血管再生在放疗区骨组织再生中尤为重要［12］。在本实验中，通过将BMSCs膜片与PRP复合，在成骨的同时可以看到更多的新生血管形成，从而实现更好的骨组织的再生。

BMSCs是骨组织工程中常用的种子细胞之一，已有大量研究使用BMSCs与支架材料进行骨的再生。通过Vc连续诱导法可以获得具有一定厚度的BMSCs细胞膜片。有研究表明BMSCs细胞膜片因其有细胞与细胞的接触及大量的细胞外基质而有更好的成骨效果，在BMSCs膜片中，成骨相关基因如骨钙素、成血管相关基因如VEGF等的表达都较BMSCs细胞更多，与PRP复合可以提高骨组织的再生和重建［13］。在本实验中，将BMSCs细胞膜片切割为含有大量细胞及细胞外基质的细胞聚集体，与PRP复合构建为可注射的三维凝胶状结构；这种三维结构较单纯的细胞膜片可以使细胞膜片与PRP充分接触，更好的促进细胞的增殖与分化；同时这样具有一定流动性的凝胶状结构可使用注射器将注射到种植体周围，可以解决单纯使用细胞膜片包裹种植体所存在的植入时膜片脱落等问题，对于种植体周围的骨缺损也可促进骨组织的再生。

综上，本研究发现BMSCs与PRP可以促进种植体周围骨组织的再生。为进一步证明BMSCs细胞膜片与PRP复合物在促进种植体周围成骨的能力，在后续实验中将进行大动物种植缺损的模型构建及在放疗等因素的影响下，BMSCs膜片与PRP复合物是否具有更好的促进种植体骨结合及周围骨组织再生的能力。

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