牙龈卟啉单胞菌菌毛质粒构建和蛋白纯化

陈江曼 李永刚 李新

牙周病是一种牙周组织慢性感染的炎症性疾病，由革兰氏阴性厌氧菌引起，其可导致牙齿支持组织的破坏。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）被认为是牙周病发生和疾病进展中的主要病原体［1］，可释放多种致病毒力因子［2］，其中菌毛（Fimbriae，FimA）在粘附到宿主细胞，促进细菌的入侵和感染中发挥着关键作用［3］。本研究拟通过基因克隆及重组技术构建P.gingivalisFimA可原核表达质粒，纯化FimA融合蛋白，为临床进一步研究P.gingivalis，制备牙周病亚单位疫苗提供部分实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

标准株P.gingivalisATCC33277（由中国医科大学馈赠）；载体 PGEX-6P-1、（E.coil）DH5α感受态细胞、限制性内切酶XhoⅠ和BamHⅠ、LA Tap酶及PMD19-T载体（TaKaRa公司，日本）；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Axygen公司，美国）；蛋白亲和层析GST-SefinoseTMKit（上海生工生物工程有限公司）；异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）等（北京索来宝科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙龈卟啉单胞菌培养及基因组提取 将－80℃冻存的P.gingivalisATCC33277菌株在室温解冻，接种于改良的脑心浸出液肉汤（BHI）固体培养基（加入1 mg／L维生素K，1 g／L酵母提取物及5mg／L氯化血红素）平皿中，37℃厌氧条件下培养4 d，在无菌超净台中刮取表面菌落，接种于BHI液体培养基中，约24 h待细菌长至对数期，离心弃上清收集菌体，采用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取P.gingivalis基因组DNA。

1.2.2 PCR扩增目的基因 根据GenBank提供的P.gingivalisATCC 33277 FimA序列，运用 Premier 5.0软件设计引物，上游引物 F：5′-3′ATTAGGATCCATGGTGGTATTGAAGACCAGC，下 游 引 物 R：5′-3′ATATCTCGAGCCAAGTAGCATTCTGACCAACGAG。采用LA Tap酶进行FimA基因扩增，反应条件为：94℃变性5 min，94℃30 s、58℃30 s、72℃2 min，共25个循环，72℃延伸5 min，逐渐降至4℃。PCR产物由琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PGEX-6P-FimA可原核表达质粒的构建及鉴定 凝胶电泳分析，扩增的PCR产物与FimA片段大小一致，切取目的条带回收纯化。将纯化的PCR产物与PMD19-T载体连接过夜，取10μl体系加入200μl DH5α感受态细胞中，冰浴30 min，42℃热击1 min，再冰浴2 min，加入400μl无抗生素的LB培养基，37℃轻摇60 min，取适量混合液涂于含氨苄青霉素（Ampicilin）的LB固体培养基平皿中，37℃过夜。次日，挑取单个白色菌落，接种于5 ml LB液体培养基中，37℃摇至对数期，离心弃上清小量提取质粒DNA并命名为PMD19-T-FimA。XhoⅠ／BamHⅠ双酶切重组质粒，琼脂糖凝胶电泳检测后送至公司测序。分别用XhoⅠ／BamHⅠ双酶切测序正确的PMD19-T-FimA质粒和空载体PGEX-6P-1质粒，回收目的片段。按照片段：载体＝7∶3（质量比）对酶切产物进行连接，将体系与DH5α感受态细胞混匀，按上述方法转化并小量提取质粒DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检验，将重组质粒命名为PGEX-6P-FimA。

1.2.4 FimA融合蛋白表达条件 挑取PGEX-6P-FimA单个白色菌落接种于30 ml含Ampicilin的LB培养基中，37℃ 180 r／min震荡，待菌液A值在0.6～0.8之间，分别设置不同 IPTG诱导浓度（0、0.1、0.3、0.5、0.7、1 mmol／L），不同诱导时间（4、6、8、12、16 h），在不同温度下（16、20、25、30、37℃）收集2 ml菌液，4℃8 000 r／min离心10 min，弃上清。用200 μl磷酸缓冲盐溶液（PBS）充分重悬菌体，冰浴超声破碎，直至清亮，4℃离心10 min，分别收集上清及沉淀，经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色检测最适诱导条件。

1.2.5 FimA融合蛋白大量表达及纯化 通过上述实验结果对比，在16℃，IPTG浓度为1 mmol／L条件下，诱导600 ml A600为0.74的菌液12 h，4℃离心弃上清，用20 ml PBS重悬菌体，按1∶100的比例加入200 μl苯甲基磺酰氟（PMSF），冰浴超声直至清亮，4℃8 000 r／min离心30 min，弃上清，用 20 ml GuMCAC-0（20 mmol／L Na3PO3·12H2O，0.5 mmol／L NaCl，6 mmol／L盐酸胍，pH7.9）充分溶解，4℃过夜。次日，4℃4 000 r／min离心30 min，收集油性上清加入至超滤离心管中，4℃4 000 r／min离心，并逐渐用不含咪唑的 MCAC-0缓冲液（20 mmol／L Na3PO3·12H2O，0.5 mmol／L NaCl，pH7.9）置换，待液体清亮后，将液体加入到GST凝胶层析柱中，控制流速缓慢过柱，抽提／平衡缓冲液（140 mmol／L NaCl，10 mmol／L Na2HPO4，1.8 mmol／L K2HPO4，pH7.5）流洗凝胶，直至无蛋白流出。最后用5～10倍凝胶体积的洗脱缓冲液（50 mmol／L Tris-HCl，33 mmol／L Glutathione，pH8.0）进行洗脱并收集液体，－80℃保存。

1.2.6 FimA融合蛋白鉴定 取少量洗脱液制样行SDS-PAGE电泳，切取凝胶15 V，20 min半干转至聚偏二氟乙烯膜（PDVF膜），于室温用5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST缓冲液稍加浸洗后将膜放入1∶2 500稀释的GST抗体中，摇床4℃过夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体为二抗，室温孵育1 h，ECL显色液检测。

2 结 果

2.1 PCR扩增FimA基因

小量提取的细菌 DAN浓度为0.125μg／μl，A260nm／A280nm＝1.85，说明DAN纯度较好，无RNA酶污染。用提取的DNA为模板，LA Tap酶扩增目的基因，电泳显示在1 000 bp处有一特异性条带与FimA大小（1 044 bp）一致（图 1）。

图1 LA Tap酶扩增FimA基因Fig 1 LA Taq enzyme amplified FimA gene

2.2 重组质粒构建

将PMD19-T-FimA质粒和空载体PGEX-6P-1进行XhoⅠ／BamHⅠ双酶切，回收目的片段并连接，双酶切验证。电泳显示有和预期大小一致的酶切片段，证明质粒构建成功，命名为PGEX-6P-FimA（图2～4）。

2.3 FimA融合蛋白诱导表达

将重组质粒PGEX-6P-FimA在大肠杆菌中少量表达，经过不同诱导条件，超声裂解各菌体，收集上清及沉淀，SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝检测各条件下是否释放蛋白及蛋白存在形式。结果显示，在16℃，IPTG浓度为1 mmol／L，诱导12 h时蛋白量最多，且主要以包涵体形式存在（图5）。

图2 XhoⅠ／BamHⅠ双酶切PMD19-T-FimA质粒Fig 2 The XhoⅠ／BamHⅠ digested plasmid PMD19-T-FimA

图3 XhoⅠ／BamHⅠ双酶切载体PGEX-6P-1质粒Fig 3 The XhoⅠ／BamHⅠ digested plasmid PGEX-6P-1

图4 XhoⅠ／Bam4HⅠ双酶切PGEX-6P-FimA质粒Fig 4 The XhoⅠ／BamHⅠ digested plasmid PGEX-6P-FimA

2.4 FimA融合蛋白纯化及鉴定

在最适条件下大量诱导FimA融合蛋白，通过对包涵体变性和梯度复性，4℃条件下与谷胱甘肽－琼脂糖介质结合，经过流洗杂蛋白、洗脱等步骤，收集纯化的FimA融合蛋白进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。如图6得到了纯度较好的FimA融合蛋白，在约60 000处有一明显特异性条带，与融合蛋白大小预期相符（图7）。

图5 最适诱导条件Fig 5 Optimum inducing condition

图6 洗脱蛋白Fig 6 Elution protein

3 讨 论

口腔内特有的环境利于细菌的生长和繁殖，细菌的存在易刺激牙菌斑的形成，牙菌斑长期累积在硬组织和软组织上则形成牙结石。虽然细菌的定居与侵入区域受到牙菌斑细菌和宿主先天防御机制之间的共同控制［4］，大多处于动态平衡，但是当菌块延伸至龈下时可触发免疫系统失衡［5］。目前，我国慢性牙周病发病率高达85%以上，是导致成年人牙齿丧失最主要的原因［6－8］，同时牙周病也可对其它全身疾病起到促进作用，甚至对个人生活质量及社会工作造成很大的影响［9－12］。

虽然临床治疗可以将受损的牙周组织恢复到原始形态，但其病变区域极易受到细菌的连续侵袭，可再次诱发牙周病的发生，因此应该针对疾病预防建立有效的牙周保健系统［13］。研究开发针对牙周病细菌的疫苗一直是牙周病治疗的辅助方向之一。在动物牙周病实验模型中，用灭活的P.gingivalis全细胞免疫发现可以减少该菌在龈下的数量并可减轻牙槽骨的吸收程度［14］，这提示疫苗可能成为预防和治疗牙周病的有效措施。

本实验旨通过目的基因克隆及构建可原核表达质粒，纯化带有GST标签的FimA融合蛋白。GST标签为谷胱甘肽巯基转移酶标签，其转移酶可与底物特异性结合，同时GST标签有高特异性，能较好的保留蛋白的抗原性和生物活性。在实验过程中IPTG浓度、时间及温度的变化都会影响融合蛋白的表达，本实验经过多次诱导表达显示，融合蛋白主要以包涵体形式存在，在16℃，IPTG浓度为1 mmol／L，诱导12 h时蛋白表达量最多，值得注意的是，GST标签包涵体蛋白需要经过变性及梯度复性才能较好的与谷胱甘肽结合。经过SDS-PAGE和Western blot检测，在约60 000 bp处显示出特异性条带，与预期蛋白大小相符。上述实验结果显示，本实验纯化出了特异性较高的FimA融合蛋白，为后续制备多克隆抗体，进一步研究FimA特性和在牙周病发生发展中的作用及临床牙周病亚单位疫苗的研制提供了部分实验基础。

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