基于纳米压痕实验的犬牙周膜弹性模量研究

傅肄芃 王耀骏 吴斌 黄辉祥 严斌

口腔正畸治疗中，牙周膜的应力与应变是牙齿移动的始动因素［1－2］，许多关于正畸牙移动过程中骨改建的理论都是基于这一假说，即应力与应变可以控制成骨细胞与破骨细胞的分化和活性。而牙周膜弹性模量则能反映牙周组织加载后初始的应力与应变关系。因此，准确认识牙周膜的弹性模量可以分析牙周组织的应力与应变［3］，了解矫治器的作用机制及力学性能，并确定不同矫治系统对牙齿的施力与牙齿位移的关系，进而实现正畸牙的有效移动，合理分配正畸治疗时间，完善矫治系统［4］。

目前，国内外学者对于牙周膜弹性模量的研究［5］在以下方面仍存在不足：一方面，由于牙周膜结构的复杂性以及实验对材料和仪器的要求很高，所以实验结果准确性较差。不同文献报道的牙周膜弹性模量范围为0.01～1 750 MPa［6］，研究结果的差异很大。另一方面，大部分研究都是将牙周膜作为各向同性的生物材料，忽视了牙周膜不同部位以及位于同一牙根轴向不同位置可能存在的性质差异［7］。

在正畸牙受力情况下，一侧牙周膜受压力压缩，另一侧受拉力拉伸［8］。对于牙周膜的拉伸实验，国内外许多学者已进行了大量研究［9］，而对压缩性能有关的研究较少，且集中于宏观测试。近年来，纳米压痕技术开始用于各种工程材料以及软硬组织［10－11］力学性能的研究，此技术通过类似于针尖样的压头压入样品表面而产生的印记来计算样品的各项力学参数，是一种检测材料微小区域力学性能的有效实验手段，其精度可达纳米级别。此外，纳米压痕还具有定点测试、对样品形状要求不高、操作简单等优点。在口腔医学领域主要用于牙釉质［12］、牙本质［13］等硬组织力学性能的测量，或是对粘结剂［14］、烤瓷牙冠材料等口腔用材料性能的验证，而对于生物软组织的研究较少。所以，为了完善牙周膜受压力情况下的生物力学性能研究，本研究应用纳米压痕技术定量测定沿牙长轴不同层面和同一层面牙根不同方位（舌侧、颊侧、近中、远中）的动物牙周膜弹性模量，分析差异并探究影响牙周膜弹性模量的可能因素。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料与仪器

健康比格犬4只［雌性，2岁龄，南京医科大学伦审（2015）169号］，空气针法处死后制取样本。

切片石蜡（上海华灵康复机械厂）（熔点56～58℃）；迷你钢锯（SATA，10in），低速切割机（IsoMet，Buehler，500 r／s，USA）；纳米压痕仪（Micro Materials，TM600，UK）；照片处理软件 IMAGE ACCESS（Version 5.30，IMAGIC-Imaging Solutions，Germany）；图表制作软件Origin（Version 9，origin-lab，USA）。

1.2 实验方法

1.2.1 样本制作与处理 实验动物处死后立即将下颌骨分离，去除肌肉、黏骨膜等软组织，沿下颌两侧第一磨牙近中和远中邻牙间隙锯断，使之与颌骨分离，得到8个含完整磨牙、牙周膜与牙槽骨的骨块。随后用石蜡将其包埋，用低速切割机在生理盐水滴注冷却下沿垂直于牙长轴的方向平行切片（图1），制成厚度为（2.0±0.3）mm的样本，每颗磨牙取3个切片样本，根据其在牙根中的位置不同分为根中、根尖、颈缘3组，共获取24个样本。

图1 样本切片部位示意图（A）以及横断面切片样本（B，×10）Fig 1 Schematic diagram of the longitudinal location of the sample（A）and photograph of a typical transverse section of the sample（B，×10）

使用记号笔对根中，根尖，颈缘3组每个样本近远中，颊舌侧4个方位标记压入点，以利于在纳米压痕仪配备的显微镜下寻找定位。试件制作完成后置于生理盐水中于 －20℃［15］冻存。

1.2.2 纳米压痕实验原理 通过测定已知各项力学参数的压头在样品表面留下的印记而推测样品力学参数的方法称为压痕技术。而纳米压痕技术又是传统压痕技术在测量微小样品时的具体应用。纳米压痕仪主要由扫描控制系统、传感系统以及压头3个部分组成。其中，压头是影响实验结果的重要因素，平头压头［16］（与样本接触面为平面）比较适合软材料弹性模量的测试［17］。

一个完整的压痕过程通常包括两部分，即加载过程和卸载过程［18］。图2是利用纳米压痕测试仪测得的材料典型的加载－卸载过程的载荷－压痕深度关系曲线。

图2 纳米压痕实验压头压入牙周膜加载示意图（A）和移位曲线（B）F：Load；Fmax：Maximum load；h：Displacement；hmax：Maximum displacement；hR：Displacementafter unloading；S：Elastic contact stiffnessFig 2 Schematic diagram of nanoindentation test（A）and loaddisplacement curve（B）

为研究材料的粘弹性蠕变行为，通常加载过程和卸载过程的中间加入一个保载的过程，即在某一段时间内，保持压头的载荷不变，此时压头位移会继续增加，如在载荷位移曲线上表现出一个平台的阶段，可认为材料发生了蠕变。由Oliver-Pharr［13］提出而又广泛被采用的纳米硬度理论，约化弹性模量E*（reduced modulus）可由下式获得：

经过预处理后，缺陷已被清晰地呈现出来。为了识别出缺陷，需要对缺陷的特征进行提取，提取的特征量能否准确地描述缺陷，这对后续的识别具有关键作用。

其中，纳米压痕压头与被测物体的接触面积Ac＝πr2，β是与压头形状有关的常数。对于圆形压头，β＝1，则有：

Oliver和Pharr推导出卸载段曲线的载荷与压痕深度公式：

其中，F为压痕载荷，C和m为通过Origin软件对载荷位移曲线进行拟合得到的拟合参数，h为压痕深度，hR为残余压痕深度，由于卸载刚度S＝dF／dh，对公式3求导，可得到卸载刚度：

代入公式2，可得约化弹性模量E*。

1.2.3 实验设计 比格犬牙周膜切片样本以所在牙根不同层面（颈缘、根中、根尖）为依据分为3组，每组8个样本。每个样本均有近中、远中、舌侧、颊侧4个方位。在显微镜下找到牙周膜区域压入点，牙周膜与牙体组织、骨组织在镜下有明显差别（图3）。

图3 纳米压痕仪显微镜下犬牙槽骨、牙周膜、牙骨质组织图（×100）Fig 3 Micrographs of alveolar bone，PDL and cementum （×100）

显微镜下每个方位定义2×2的矩阵点，每个点均使用平头压头以0.1 mN／s向牙周膜内压入，直到应力到达1 mN后维持20 s保载时间，牙周膜得到充分的形变。然后以0.1 mN／s应力减少速率进行卸载，直至压头离开牙周膜表面。每个压入点重复加载5次，绘制纳米压痕的载荷－位移曲线，并根据公式计算牙周膜的弹性模量。以图4示例，取卸载初期斜率。

1.3 统计学方法

使用统计分析软件 SPSS（Version 19.0，IBM，USA）对数据进行统计分析，评价牙根层面因素以及牙周膜方位因素对牙周膜弹性模量的影响，P＜0.05为差异有统计学意义。

图4 犬牙周膜样本纳米压痕实验载荷－位移曲线图Fig 4 Load-displacement curve of beagle＇s PDL from nanoindentation test

2 结 果

对于24个样本的纳米压痕实验数据，分别计算弹性模量并按照所处牙周膜不同区域进行统计分析（表1）。

实验结果显示，比格犬牙周膜弹性模量最小值位于牙根颈缘样本的颊侧部位，为（0.452±0.118）MPa，最大值位于根中样本的近中方位，为（1.542±0.591）MPa。表2析因设计方差分析显示，牙根同一层面不同方位这一变异来源对牙周膜弹性模量具有显著性影响（P＜0.05），而牙根层面和两者交互作用因素对牙周膜弹性模量影响不显著。进一步两两比较可知（表3），颊舌侧与近远中方位的牙周膜弹性模量具有显著性差异，但颊侧与舌侧、近中与远中没有显著性差异。

表1 纳米压痕实验获得的不同区域牙周膜弹性模量表 （±s，MPa）Tab 1 Elasticmodulus of various locations（x±s，MPa）

表1 纳米压痕实验获得的不同区域牙周膜弹性模量表 （±s，MPa）Tab 1 Elasticmodulus of various locations（x±s，MPa）

牙根层面牙根方位舌侧 颊侧 近中 远中根中 0.716±0.380 0.600±0.366 1.542±0.591 1.190±0.254根尖 0.663±0.135 0.973±0.845 0.967±0.718 1.011±0.781颈缘 0.477±0.269 0.452±0.118 1.163±0.640 1.143±0.506

3 讨 论

在生物力学研究领域，纳米压痕实验方法多用于硬质材料的力学研究［19］，对于软质地材料，尤其是生物软组织材料研究较少。近年来，有学者［20］提出了采用纳米压痕仪研究牙周膜弹性模量的方法，本研究在该方法础上进行了具体的实验验证。以往纳米压痕实验中应用最多的是Berkovich压头，为一圆锥形压头，会对软组织材料产生破坏性；故本研究采用了圆柱形平面压头，该压头能与被测表面充分接触，并可减少尺寸效应带来的测量误差，较适用于软组织材料的测试［17，21］。实验中，对每压入点使用平头压头以 0.1 mN／s向牙周膜内压入，直到应力到达 1 mN［21］，该大小的应力不会对牙周纤维产生破坏。从图4可以看出，在保载过程中压痕深度仍在增加，这说明牙周膜发生了蠕变［22］，体现了其粘弹性特征。由于蠕变这一现象的存在，较小的卸载率可能会导致卸载曲线的斜率出现负值，出现无法计算弹性模量的情况，可通过设置较大的卸载率或者增加保载时间减少蠕变对于实验的影响。

表2 纳米压痕实验的牙周膜弹性模量牙根层面、方位方差分析Tab 2 Variance analysis of different locations（circumferential and longitudinal）

表3 牙根方位间两两比较方差分析（LSD）Tab 3 Least significant difference（LSD）of PDL locations

目前部分学者认为牙周膜弹性模量约为1 MPa［23－24］，本研究通过纳米压痕实验法测得的犬弹性模量介于（0.452±0.118）MPa与（1.542±0.591）MPa之间，与之相近。由于实验中选取了牙根不同层面、不同方位的压入点，不同压入点之间的弹性模量存在差异。由于目前较为缺少类似的牙周膜微观实验数据支持，该部分内容的精确性和结论的可靠性需要后续实验进行验证。

本研究将实验对象按沿牙长轴方向对不同层面分成颈缘、根中、根尖3组，由两两比较可知，牙根轴向层面因素对牙周膜弹性模量的影响不具备统计学意义。同时，对每个层面的样本选取近中、远中、舌侧、颊侧四个方位进行纳米压痕实验，统计学分析显示，牙周膜方位因素显著影响了牙周膜弹性模量。关于牙周膜弹性模量的单轴拉伸实验［25］也得出类似结论，即牙周膜方位因素对于牙周膜弹性模量的影响大于牙根层面因素，但由于纳米压痕实验获得的弹性模量只代表牙周膜在实验位点处的微观表征，而单轴拉伸实验所获得的弹性模量可以认为是无数个微观位点弹性模量的总体表征，并且具体计算方法和遵循的理论依据也都不同。此外，本实验研究结果显示，颊舌侧方位与近远中方位牙周膜弹性模量具有显著性差异。这与国外学者Uhlir等［26］对牛下颌中切牙横断面切片做轴向拉伸实验，得到实验组颊舌侧与近远中部分牙周膜弹性模量有显著差异的结论相符。推测可能与牙周膜的弹性模量与牙周膜纤维密度、纤维分布、方向以及牙周膜厚度等因素有关。实验中，颊舌向弹性模量小于近远中，可能由于在比格犬后牙的咀嚼侧向运动中，颊舌侧所受的力大于近远中，其较小的弹性模量支持了颊舌侧牙周膜在受到较大应力的情况下，产生较小的应变，即相同应变下，可较近远中承载更大的应力。而颊侧与舌侧、近中与远中牙周膜弹性模量比较结果显示没有显著性差异。此结果对于临床上正畸牙不同方向移动时施加力的大小选择，以及牙拔除时施力大小和方式可能有一定的指导意义，但还需要进一步的临床研究来推理验证。

本实验测量位点多，当某些位点的载荷－位移曲线有明显异常时可以摒弃并及时补测，从而有效减少实验误差。但是实验中仍存在不足之处：本实验的研究对象是实验动物比格犬的牙周膜，比格犬牙周膜的组成与人牙周膜相似，但牙根形态、牙周膜厚度等与人牙齿有所不同，所以其生物力学性质与人牙周膜应当有所不同；且本实验仅研究了比格犬磨牙的牙周膜，对于不同牙位牙周膜弹性模量的差异以及牙周膜在体内环境的生物力学性质等都有待今后进一步的研究。

4 结 论

本研究在微观力学角度对比格犬磨牙牙周膜弹性模量进行了初步研究，得出了以下结论：①基于纳米压痕法测得比格犬牙周膜弹性模量约为0.452～1.542 MPa；②比格犬下颌磨牙沿牙长轴不同牙根层面的牙周膜弹性模量没有明显差异；③比格犬下颌磨牙沿牙长轴同一层面不同方位的牙周膜弹性模量存在明显差异。

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