正交优化蚁狮黄酮超声提取工艺

王颖娟张　培李子忠

（1.兴义民族师范学院民族药用生物资源研究与开发实验室，贵州　兴义　562400 2.贵州大学昆虫研究所，贵州　贵阳　550025）

蚁狮(Antlion)，别名地牯牛、沙猴、倒退虫、沙牛等，隶属脉翅目Neuroptera蚁蛉科Myrmeleontidae，是一种药用价值很高的昆虫。其有平肝熄风、解热镇痉、祛瘀散结、拨毒消肿、通便泻下、截疟杀虫之功效；主治小儿高热惊厥、癫痫、中风等症[1-3]。蚁狮作为传统的药用昆虫，为全虫入药，但其有效部位尚不明确。前期试验表明蚁狮醇提物具有较好的抗炎抑菌作用，经检测醇提物中含有较多的黄酮类物质。

目前多见植物类黄酮的相关文献报道[4-9]，鲜见昆虫体内含有黄酮以及其提取技术的报道。超声波机械热振动的传播过程中有助于有效成分的溶出和扩散，增加提取物的得率[10-11]，超声波辅助提取法已广泛应用于植物次生代谢物质的提取[12-14]。本实验以蚁狮为研究对象，研究冷浸法[13]、传统的索氏浸提法[14]、超声波法[12]对蚁狮黄酮提取率的影响，并对最佳提取方法进行了正交优化[15]提取条件的研究，以寻求一种快速、简便、有效地提取方法，为今后昆虫体内黄酮的研究奠定基础。

一、材料

1.仪器

UV-1601型紫外一可见分光光度计 (北京瑞利分析仪器公司)；JAl003N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；SG2200HPT型超声波洗涤机(上海冠特超声仪器有限公司)。

2.药品及试剂

芦丁(生化试剂，上海晶纯试剂有限公司)；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等化学试剂均为分析纯(AR)。

蚁狮采自贵州省贵阳市森林公园，饲养至成虫后，成虫标本经中国农业大学王心丽教授鉴定为锈翅蚁蛉Myrmeleon ferrugineipennis Bao&Wang,2009。

二、方法

1.标准曲线的制备

以芦丁为对照品，加入NaNO2，还原提取液中的黄酮类化合物，再加入Al（NO3）3，使黄酮类化合物与铝离子络合，形成稳定的化合物，再加入Na0H使其显色，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰，故提取液中黄酮的含量与其吸光度有关。

（1）最大吸收波长的选择

精确称取5mg芦丁标准品烘干至恒重，用60%的乙醇溶液溶解，定容至100mL，摇匀，得浓度为0.05mg/mL的标准液。

精确量取芦丁标准液2mL，加5%NaNO20.3mL，摇匀，静置6min，加10%Al（NO3）30.3mL，摇匀，静置6min，加4%Na0H溶液4mL，用60%的乙醇溶液定容至10mL，摇匀，在400nm～600nm波长处扫描，结果在510nm处有最大吸收。

（2）标准曲线的绘制

精确量取芦丁对照品溶液 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分别置于10mL的比色管中，均用60%的乙醇溶液补充至5mL，各加5%NaN02溶液0.3mL，摇匀，放置6min；然后各加10%的Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀，放置6min；然后各加4%的NaOH溶液4mL摇匀，最后用60%的乙醇溶液补充到刻度，混匀，放置15min，以试剂空白为参比，在最大吸收波长510nm处测定吸光值。以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程 A=6.7733c+0.0034，R2=0.9995。

2.黄酮提取工艺及含量测定

精确称取0.50g蚁狮鲜虫置于研钵，反复冻融，研磨至虫浆，放入磨口三角烧瓶中，加入乙醇溶液，超声波辅助提取，过滤，石油醚脱色处理后，所得滤渣用70%乙醇溶液溶解并定容至50mL，作为待测液，按（2）项进行操作，测定黄酮含量。

3.单因素试验

（1）不同溶剂的选择

精确称取2份0.50g蚁狮，以料液比为l︰20，超声功率为50W，分别加入95%甲醇和95%乙醇提取30min。计算蚁狮黄酮提取率。

（2）不同提取方式的选择

精确称取0.50g蚁狮3份，以料液比为l︰20，加入95%乙醇，冷浸法静置抽提6h，索氏提取法提取4h，超声波提取30min，计算蚁狮黄酮提取率。

（3）乙醇体积分数的选择

精确称取0.50g蚁狮6份，以料液比为l︰20，超声功率为50w，分别加入50%，60,%，70%，80%，90%，100%的乙醇提取30min。计算蚁狮黄酮提取率。

（4）液料比的选择

精确称取0.50g蚁狮6份，以95%的乙醇溶液分别以料液比为 l︰5，l︰10，l︰15，l︰20，l︰25，l︰30的量加入，超声功率为50w，提取30min。计算不同料液比下蚁狮黄酮的提取率。

（5）提取时间的选择

精确称取0.50g蚁狮5份，以料液比为l︰20，超声功率为50w，加入95%的乙醇溶液，在超声时间分别为20min，40min，60min，80min，100min的条件下提取，计算不同提取时间下蚁狮黄酮的提取率。

4.正交试验设计

在单因素试验的基础上，进行正交优化设计，以料液比（A）、提取时间(B)、乙醇浓度(C)3个因素为考察指标，设计3因素3水平正交分析试验，各试验因素水平如表1所示。对获得的优化条件进行3次验证试验。

表1　锈翅蚁蛉幼虫黄酮提取因素及水平

三、结果

1.单因素试验结果

（1）不同溶剂对黄酮提取率的影响

图1　不同溶剂对蚁狮黄酮提取率的影响

如图1所示，乙醇的提取效果远远高于甲醇，且乙醇对人体的伤害小于甲醇，故提取蚁狮总黄酮时，乙醇为最佳提取溶媒。

（2）不同提取方式对黄酮提取率的影响

图2　不同提取方式对蚁狮黄酮提取率的影响

由图2所示，三种提取方式中以超声波提取法黄酮得率最高，索氏提取法次之，冷浸法提取效果最差。冷浸法提取存在耗时长、提取不彻底等缺点；索氏提取法是通过热回流提取黄酮，长时间保持在高温状态下，黄酮的活性可能会被破坏；而超声波在提取溶媒中产生的‘空化效应’和机械作用可有效地破碎细胞壁，还可加速提取溶媒的分子运动，使得提取溶媒和黄酮类物质快速接触而相互溶合，使得在短时间内有较高的提取率。

（3）乙醇浓度对黄酮提取率的影响

图3　乙醇浓度对蚁狮黄酮提取率的影响

由图3可知，当乙醇体积分数较低时，黄酮的提取率随着乙醇浓度的增加而增加，在乙醇体积分数达到95%时，黄酮类物质溶出趋于饱和，而同时随着乙醇体积分数的进一步升高，提取率反而有所下降。分析原因，可能是因为蚁狮体内含有水溶性的黄酮化合物，当溶剂中没有水分时，这类黄酮物质不能被溶解，故表现为提取率下降。故提取蚁狮黄酮的最佳乙醇体积分数为95%。

（4）料液比对黄酮提取率的影响

图4　料液比对蚁狮总黄酮提取率的影响

如图4所示，随着提取溶剂用量的增加，黄酮得率也随之呈增长趋势，当液料比达到l︰25（g/mL）时，提取率最高，此时若继续增加溶剂的用量，黄酮得率反而呈缓慢下降趋势，这可能是因为液料比达到l︰25（g/mL）时，黄酮类物质已基本溶出，继续增加溶剂用量反而会促使其他杂质的溶出，使得黄酮得率下降。考虑到节约成本和后续回收操作，确定液料比为l︰25（g/mL）为宜。

（5）提取时间对黄酮提取率的影响

图5　提取时间对蚁狮总黄酮提取率的影响

由图5可知，随着超声时间的增加，黄酮提取率先增后降，在40min处提取率达到最大值。超声时间增长降低黄酮提取率的原因可能是溶解出的黄酮长时间处于超声波环境中，受超声波的影响而降解。故提取蚁狮黄酮的超声时间为40min比较合适。

2.正交试验结果

以料液比（A）、提取时间(B)、乙醇浓度(C)3个因素为考察因素进行正交试验，结果见表2，表3。由直观分析和方差分析可以看出，各因素对蚁狮黄酮得总率率的影响顺序为C﹥A﹥B，因素C、因素A对蚁狮总黄酮提取有显著影响（0.01＜P≤0.05），因素B对其影响不明显。正交优化工艺为A2B2C3，即料液比为1:15，提取时间为60min，乙醇浓度为90%。此工艺下进行3次验证试验，结果蚁狮黄酮的平均得率为2.13%，说明优选的工艺稳定可行。

表2　蚁狮黄酮提取正交实验结果及极差分析

表3　蚁狮总黄酮提取正交实验方差分析

四、讨论

一般认为，黄酮类化合物广泛存在植物体内，属植物的次生代谢产物[16]。而在动物体内发现黄酮类化合物目前鲜有报道，本实验测定出锈翅蚁蛉幼虫体内含有大量的黄酮类化合物，含量1000mg/100g～2000mg/100g。

本实验利用超声波辅助提取对蚁狮黄酮的提取方法和工艺进行了单因素分析和正交试验。正交试验结果得出，影响黄酮提取效果的各因素主次顺序为：乙醇浓度＞料液比＞提取时间，通过极差分析和方差分析，获得了优化的提取工艺为乙醇浓度90%，料液比1:15，提取时间60min。验证试验结果表明，优选的工艺稳定可行。

通过抗炎抑菌试验，蚁狮黄酮类物质具有一定的抑菌、抗炎效果。蚁狮体内的黄酮类化合物的种类、结构、生物活性以及是否具有与目前报道的植物体内提取的黄酮相似的功能还需进一步深入研究。

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