全自动固相萃取-高效液相色谱测定蔬菜中灭蝇胺残留

2018-04-12曹宁阳

现代食品 2018年4期

◎ 董　娇，曹宁阳，耿　鑫

（1.沈阳产品质量监督检验院，辽宁　沈阳　110072；2.沈阳食品检验所，辽宁　沈阳　110136）

灭蝇胺（Cyromazine），化学名称N-环丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一种三嗪类有机化合物。灭蝇胺有很好的选择性，主要对双翅目类昆虫有活性。其机理是使双翅目类昆虫幼虫及其蛹在形态上发生畸变，成虫羽化不全或受抑制。主要用于防治叶菜类、菜豆类和瓜果类的美洲斑潜蝇和潜叶蝇等农业害虫。灭蝇胺以其高效、低毒性、低残留、持效期长等特点，得到了世界范围内的认可，目前已经广泛应用于蔬菜蝇蛆的防治。GB 2763-2016《食品中农药最大残留限量》中规定灭蝇胺的限量指标：黄瓜中的最大残留限量值为1.0 mg/kg，其他豆类蔬菜限量值为0.5 mg/kg。

目前，灭蝇胺检测方法主要有HPLC法、HPLC-MS/MS法和GC-MS法，样品前处理方法则基本都采用固相萃取法，而手动固相萃取操作存在自动化程度低、处理能力有限、重现性差等缺陷。本文采用全自动固相萃取仪进行萃取操作，相对于传统的手动固相萃取方式，全自动固相萃取法降低了样品用量，实现了样品的自动化在线前处理，既节省了时间，又避免了操作人员直接接触有机溶剂。同时，操作简便，减少人为因素引入的误差，重现性好，大大提高了分析效率。

1　材料与方法

1.1　仪器与试剂

仪器：岛津LC20A高效液相色谱仪，配有M20A二极管阵列检测器；Sepline-s1全自动固相萃取仪，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；HZF-A500电子天平，福州华志科学仪器有限公司；均质机，T18德国IKA公司；MV5多通道平行浓缩仪，北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

试剂：SCX固相萃取柱，6 mL，500 mg，上海安谱实验科技股份有限公司；Florisil固相萃取柱，6 mL，500 mg，上海安谱实验科技股份有限公司；灭蝇胺，纯度98.0%，德国Dr .Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；氨水、盐酸，分析纯，西陇化工股份有限公司；水，高纯水。

1.2　实验方法

1.2.1标准溶液的配制

灭蝇胺标准储备溶液（100 mg/L）：准确称取灭蝇胺标准品10 mg（精确至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加入乙腈定容至刻度。分别吸取标准储备溶液50 μL、100 μL、200 μL、0.5 mL、2.0 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。配制成浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、2.0 μg/mL标准系列工作溶液[1]。

1.2.2样品的预处理及提取

将蔬菜样品取可食部分，擦去样品表面的附着物，切碎，充分混匀，捣成匀浆。匀浆放入聚乙烯瓶中于-20～-16 ℃下保存。称取样品时，常温样品搅拌均匀，冷冻样品解冻后混匀取样。

称取匀浆样品20 g（精确至0.01 g）于250 mL三角瓶中，加入40 mL甲醇-水溶液(9∶1，V/V)，高速均质2 min，滤液经垫有滤纸的布式漏斗抽滤至100 mL具塞比色管中，再用25 mL上述混合溶液清洗烧杯和均质器刀头，高速均质30 s，滤液经留有残渣的布氏漏斗抽滤，合并滤液于100 mL具塞比色管中，加入8 mL 0.5 mol/L盐酸，采用甲醇-水溶液(9∶1，V/V)定容，取出5 mL提取液至试管中待净化[2]。

1.2.3提取液的净化及浓缩

按表1中程序应用全自动固相萃取仪对样品提取液进行净化。净化后的提取液在平行浓缩仪上40 ℃吹干，用流动相定容至1 mL。

表1　自动固相萃取净化程序表

1.2.4HPLC分析条件

色谱柱，Thermo Hypersil APS2（NH2）氨基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相，乙腈+水(97+3，V/V)；流速，1 mL/min；柱温，30 ℃；进样体积，10 μL；检测器，二极管阵列检测器；检测波长，210 nm[3]。

中央门卫生服务中心（以下简称“中心”）是集医疗、康复为一体的二级综合性医院，覆盖鼓楼区8个社区7万多人口。随着医院医疗水平和服务质量的逐步提升，门诊和住院病人持续增加，原有的医疗检测设备已经不能满足日益增长的医疗市场需求。充分考虑中心的临床实际需求，结合中心的发展，2015年年底，中心引进了0.35T核磁共振成像仪（MRI），总投资204万元。为加强对MRI的运行管理，提高设备使用效率，探索大型检测设备成本运行规律，为中心宏观经济管理和长期发展战略提供决策参考，文章对核磁共振项目进行了综合效益分析。

2　结果与讨论

2.1　全自动固相萃取仪条件优化

2.1.1固相萃取柱的选择

考虑到蔬菜样品中含有较多色素，而灭蝇胺为三嗪类弱碱性化合物，所以本文选择了Florisil小柱和SCX小柱对样品进行净化。实验表明，SCX固相萃取柱对灭蝇胺的萃取效果较好，回收率较高，使用该型小柱所得萃取液干扰杂质较少。因为SCX固相萃取柱键含有苯磺酸官能团，所以上样时，样品溶液pH值会影响灭蝇胺在小柱上的吸附。本文通过在样品提取液中加入8mL 0.5 mol/L盐酸溶液，将提取液的pH值控制在2～3（不同基质pH值稍有差别），以保证其带电荷，使灭蝇胺在洗脱之前能够更好地保留在小柱上。Florisil小柱除去样品中的色素效果明显，但目标物灭蝇胺的回收率低于采用SCX小柱时所得到的结果。应用两种固相萃取小柱净化的方法检出限没有数量级上的差别。综合考虑以上因素，本方法选择SCX小柱作为净化柱[4]。

2.1.2固相萃取条件优化

由于叶菜类和豆荚类样品含有色素较多，当上样量太大容易使小柱穿透，本方法选择上样体积为5 mL。应用SCX小柱进行净化时，保持目标物带有电荷可以更好地使目标物吸附在小柱上，有效提高回收率。实验中对不同淋洗液的淋洗效果进行了比对，在其他条件相同的情况下，分别采用0.1 mol/L的盐酸和纯水作为淋洗液进行淋洗，对目标物回收率的影响并不明显。同时，考虑到溶剂的环境友好性，最终选择采用纯水进行第一次淋洗，再用甲醇进行第二次淋洗，用以除去提取液中的极性干扰物质。SCX柱的洗脱液应为碱性溶液，一般为不同配比的氨水-甲醇洗脱液[5]。本文比较了5%的氨水-甲醇、10%氨水-甲醇、20%氨水-甲醇洗脱液，发现体积比为5∶95时洗脱效果较好，回收率高。应用5 mL上述5%的氨水-甲醇洗脱液，洗脱3次和洗脱两次的回收率分别为86%和82%，为减少有机试剂的使用量，本文选择5 mL 5%的氨水-甲醇洗脱两次作为洗脱程序[6]。上样流速和洗脱流速也会影响目标物回收率。上样速度太快，样品来不及与小柱作用就流出小柱，降低回收率。洗脱速度过快，洗脱溶剂没有时间和目标物充分接触，无法将样品从小柱上充分洗脱下来，也会降低目标物回收率。本文充分考虑上述影响条件，确定上样及洗脱的流速分别为1、2 mL/min[7]。

2.2　线性范围及检出限

将标准系列工作溶液按1.2.4色谱条件进行检测，以对应的色谱图峰面积为纵坐标（Y，响应值）、质量浓度为横坐标（X，μg/mL）进行回归分析。结果表明：灭蝇胺在浓度0.05～2.0 μg/mL呈良好的线性关系，回归方程为Y=9.09e-006X+0.0075，线性相关系数（r）为0.9995。方法检出限为0.02 mg/kg（信噪比RSN=3）。灭蝇胺的高效液相色谱图，如图1所示[8]。