高效液相色谱法同时检测配制酒中9种合成着色剂

2018-04-12刘子雄刘映铄郑鸿涛

现代食品 2018年4期

◎ 刘子雄，刘映铄，郑鸿涛

（中山市食品药品检验所，广东　中山　528437）

配制酒是指以蒸馏酒、发酵酒或食用酒精为酒基，以食用动植物、食品添加剂作为呈香、呈味、呈色物质，按一定工艺加工而成，改变了其原酒基风格的饮料酒。其生产工艺允许添加一定量的着色剂改善其色泽，而合成着色剂因性质稳定，染色效果好，成本低廉易得，用量少等特点受到不少食品企业的青睐。但是，过量摄入合成着色剂会对人体健康造成一定的危害。因此，GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[1]对允许添加的合成着色剂使用量作了相关规定。

目前，合成着色剂主流检测方法是高效液相色谱法，其中GB 5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》[2]涉及7种着色剂的检测，SN/T 1743-2006《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法》[3]涉及4种着色剂的检测，共包含9种合成着色剂，分别为柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红（偶氮玉红）和赤藓红。GB 5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》中赤藓红的前处理方法与其他着色剂的前处理方法又不同，并不是利用聚酰胺粉吸附原理而是利用液液萃取进行处理，在日常检测工作中，特别是大批量多项目合成着色剂检测工作中，往往造成一个样品多次前处理，分别检测，给日常检测工作带来不便，不仅检测时间大大延长，对检测资源也造成一定的浪费。以下根据GB 5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》、SN/T 1743-2006《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法》和GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[4]的要求，参考有关文献[5-7]，再结合日常检测工作的经验，利用聚酰胺粉吸附原理，对配制酒中合成着色剂进行提取和净化，使用高效液相色谱仪和二极管阵列检测器同时进行9种合成着色剂的检测。

1　实验部分

1.1　仪器和试剂

仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪，G1315D 1260DAD检测器；Milli-Q Integral 3 System纯水系统；SSW-600-2S型电热恒温水槽；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵。

试剂：标准物质柠檬黄（纯度95.5%）、新红（纯度89.0%）、苋菜红（纯度92.8%）、胭脂红（纯度98.2%）、日落黄（纯度90.5%）、诱惑红（纯度86.3%）、亮蓝（纯度92.3%）、酸性红（纯度93.5%）、赤藓红（纯度91.0%），均由德国Dr.Ehrenstorfer公司提供；色谱级甲醇（默克）和乙酸铵（阿拉丁）；分析纯甲醇，甲酸，无水乙醇，氨水，柠檬酸；层析用聚酰胺粉100～200目；一级水；配制酒试样，购自超市。

1.2　溶液的配制

标准溶液按GB 5009.35-2016方法要求配制，固体纯品型标准品需根据纯度折算浓度。pH=5的甲醇-水（V∶V=6∶4）：量取分析纯甲醇60 mL，纯水40 mL，混匀，然后用甲酸调节pH到5。乙醇-氨水-水（V∶V∶V=7∶2∶1）：量取乙醇70 mL，氨水20 mL，纯水10 mL，混匀。柠檬酸溶液：称取20 g柠檬酸，加水溶解并稀释至100 mL。pH=5的水：水中加柠檬酸溶液调pH到5。乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：称取1.54 g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000 mL。

1.3　样品前处理

称取样品10 g（精确至0.001 g）至200 mL烧杯中，加水约40 mL混匀，用pH=5的水调节pH至酸性，置于60 ℃电子恒温水浴锅中，加入约1 g聚酰胺粉，搅拌。静置至上层水溶液呈无色透明时，趁热将样品溶液倒入G3垂融漏斗中抽滤，用pH=5的水洗涤3次，每次10 mL，然后用pH=5的甲醇-水洗涤3次，每次10 mL，弃洗涤液。换干净的抽滤瓶，用乙醇-氨水-水解吸3～5次，每次10 mL，直至色素完全解吸，收集解吸液至200 mL烧杯中，置于80 ℃电热恒温水槽中浓缩至约2～3 mL，加水定容至10 mL，经0.45μm PTFE微孔滤膜过滤，使用高效液相色谱仪分析。

1.4　色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipae Plus C18（4.6×250mm 5-Micron）。流动相：色谱甲醇（A）和0.02 mol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱，见表1。流速：1.000 mL/min。柱温箱温度：35 ℃。进样量：10 μL。DAD检测波长：亮蓝检测波长为575 nm，其他为480 nm（波长变动时间设置为0～8.20 min，480 nm；8.21～8.57 min，575 nm；8.58～10.05 min，480 nm）。

表1　梯度洗脱条件表

2　结果

2.1　方法的线性和检出限

在设定的色谱条件下，9种合成着色剂色谱分离情况如图1所示，线性方程及相关系数见表2。在本实验条件下，按照信噪比S/N=3计算检出限，结果见表2。

图1　混合标准溶液色谱图

表2　9种合成着色剂的线性方程、相关系数和检出限表

2.2　方法的准确度

方法准确度用样品加标回收率表示，对试样进行3个浓度水平加标，每个水平进行3次重复测定，结果见表3。

表3　9种合成着色剂加标回收率表

2.3　方法的精密度

方法精密度用相对标准偏差表示，自制含有9种着色剂的配制酒试样，进行7次重复测定，计算精密度，结果见表4。

表4　9种合成着色剂的方法精密度表（n=7）

3　讨论

3.1　波长的选择

GB 5009.35-2016和SN/T 1743-2006方法均采用254 nm作为检测波长，但是在实际检测过程中，特别是基质较复杂的样品，容易造成干扰，出现假阳性，而且亮蓝在254 nm处响应也较低。亮蓝波长选择为575 nm，响应明显提高，其他着色剂波长选择为480 nm，基质干扰明显降低。

3.2　淋洗液的选择

GB 5009.35-2016和SN/T 1743-2006方法均选择甲醇-甲酸（V∶V=6∶4）作为其中一种淋洗液。实验发现，由于酸性过强，当以甲醇-甲酸淋洗吸附有赤藓红的聚酰胺粉后，赤藓红被一并洗脱下来，回收率基本为零。故本方法对淋洗液进行了优化，把甲醇-甲酸更换成pH=5的甲醇-水，赤藓红的回收率显著提高，满足定量要求。