豆腐柴叶总黄酮抗氧化活性研究

◎ 曾奕秀，熊双丽，，薛朝云

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川　绵阳　621010；2.江油市春雨生态农业科技有限公司，四川　江油　621700）

黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌、降血糖及预防肿瘤等作用[1]，豆腐柴具有显著的抗炎及预防肿瘤等功能，这可能与黄酮类化合物有关[2]。目前，学者的各类研究当中，对豆腐柴叶总黄酮的总抗氧化能力及其他类型的抗氧化活性报道较少。江油豆腐柴是当地的特色旅游食品，为更好地研究该地区豆腐柴资源的生物学与功能特性，本实验使用超声波辅助提取江油豆腐柴叶总黄酮并进行其体外抗氧化活性分析，以期为江油豆腐柴资源综合开发利用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　材料、试剂与仪器

材料：豆腐柴叶，2017年9月采于绵阳江油豆腐柴基地；芦丁对照品，南京替斯艾么中药研究所。试剂：二苯基苦基苯肼基自由基（DPPH·），SIGMA ALDRICH公司；乙醇、亚硝酸钠、钼酸铵等，均为分析纯。仪器：KH3200E型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；TDL-4A台式低速离心机，上海恰菲尔分析仪器有限公司；UV-5800PC紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2　豆腐柴叶总黄酮的提取

工艺流程：洗净的豆腐柴叶→50 ℃烘干至恒重，粉碎过60目筛→准确称取1.00 g粉末→按照乙醇体积分数60%、料液比1∶40、超声温度70 ℃、超声时间40 min的参数进行提取→提取液离心（4000 r/min，10 min）→参照张丽丹等人[3]的研究方法测定上清液吸光值，计算豆腐柴叶总黄酮的得率。

1.3　豆腐柴叶总黄酮抗氧化活性的测定

DPPH·、Fe2+螯合能力及总抗氧化能力的测定参考郑义等人[4]的研究，过氧化氢清除率[5]。

Fe3+还原能力。在刘鹏飞等人[6]研究的基础上略作修改：在试管中依次加入2.5 mL不同浓度的提取液，2.5 mL pH=6.6的磷酸盐缓冲液，2.5 mL 1%铁氰化钾水溶液，摇匀，50 ℃水浴反应20 min，冷却，在试管中加入10% 的Cl3CCOOH，摇匀，离心（3800 r/min，10 min）。在试管中加入5 mL上清液，5 mL蒸馏水和1 mL FeCl3水溶液，摇匀，静置5 min，在700 nm处测定吸光值。

1.4　数据处理

实验数据由Excel 2010处理。

2　结果与分析

由图1可知，豆腐柴叶总黄酮及Vit C对 DPPH·清除率都与总黄酮质量浓度呈正相关，且前者优于后者，豆腐柴叶总黄酮质量浓度达到0.4 mg/mL时对DPPH·清除率趋于稳定，为93.01%。周劝娥等[7]的关于陕西苦菜叶总黄酮的研究发现，在总黄酮质量浓度为0.1 mg/mL和0.7 mg/mL时，其对DPPH·清除率分别为68.6%和93.6%，而本次实验在总黄酮质量浓度为0.1 mg/mL时，其对DPPH·清除率为74.54%，为0.5 mg/mL时，对DPPH·的清除率已达94.54%，由此，豆腐柴叶总黄酮对DPPH·的清除率略高于陕西苦菜叶总黄酮，故豆腐柴叶总黄酮表现出良好的抗氧化活性。

图1　豆腐柴叶总黄酮对DPPH·的清除活性图

由图2可知，豆腐柴叶总黄酮和Vit C对H2O2的清除率均随着总黄酮质量浓度的增加而增大，总黄酮对H2O2的清除率始终高于Vit C。在总黄酮质量浓度低于0.04 mg/mL时，豆腐柴圆叶总黄酮对于过氧化氢的清除率明显高于Vit C，而在总黄酮质量浓度达到0.04 mg/mL之后，豆腐柴叶总黄酮与Vit C对H2O2的清除率较为接近，分别为91.18%和89.12%。王静等[8]对紫（白）苏叶黄酮类化合物的抗氧化活性研究发现，紫（白）苏叶黄酮分别在0.09～0.12、0.06～0.09 mg/mL，达到半数清除率。在此之后，它们对H2O2清除率的增长速度均加快，本实验在总黄酮质量浓度为0.01～0.02 mg/mL达到半数清除率，之后其清除率的增加速度呈较缓慢的趋势。

图2　豆腐柴叶总黄酮对过氧化氢的清除活性图

总抗氧化能力可作为衡量提取液体外抗氧化能力的重要指标。磷钼络合法是利用当样品溶液和钼同时存在时它们竞争被还原的原理，通过测定绿色的五价钼化合物生成量测定总抗氧化能力。由于绿色的五价钼化合物在695 nm处有最大吸收值，故可通过测定吸光值的大小来判断物质的抗氧化能力强弱，吸光值越大则表示待测物质的抗氧化能力越强[9]。由图3可知，豆腐柴叶和Vit C的总抗氧化能力均与质量浓度呈正相关，且Vit C始终略高于豆腐柴叶总黄酮。在吸光值达到0.6时，豆腐柴叶总黄酮浓度为0.26 mg/mL，与曾林晖等[10]的蜂胶黄酮质量浓度为0.33 mg/mL的研究相比，其总抗氧化能力较蜂胶黄酮强。

图3　豆腐柴叶总黄酮对总抗氧化能力的影响图

使抗氧化物质失电子变为稳定的分子可使其失去活性。Fe3+易得到电子，抗氧化剂可以提供电子，从而使得Fe3+转化为Fe2+，抗氧化剂失去电子的能力越强则表示其还原能力越强。在实验中，吸光值的大小与抗氧化物质的抗氧化能力呈正相关。将图4中豆腐柴叶总黄酮对Fe3+的还原能力的曲线进行模拟得到y=4.1321x+0.1308R2=0.9964（y为吸光值，Abs；x为浓度，mg/mL），可见，其有较好的线性关系。在质量浓度为0.31 mg/mL时，豆腐柴叶总黄酮及Vit C对Fe3+具有相同的还原能力。在质量浓度低于0.31 mg/mL时，Vit C对Fe3+的还原能力较强，在质量浓度高于0.31 mg/mL时，二者趋于一致。本实验与段宙位[11]得出的沉香叶黄酮类化合物对Fe3+的还原能力经线性回归后符合线性分布的结论一致。

图4　豆腐柴叶总黄酮对Fe3+还原能力的影响图

金属离子会对人体造成损害，加入抗氧化物质可使金属离子发生螯合作用，从而减少其对于细胞的伤害，进而达到保护生物机体的作用[12]。Fe2+的螯合程度越大，物质的抗氧化能力越强。由图5可知，豆腐柴叶总黄酮和Vit C对金属铁离子的螯合率随浓度的增大呈上升趋势，豆腐柴叶总黄酮的趋势较为平缓，Vit C上升幅度较大，但在相同的豆腐柴叶总黄酮质量浓度的条件下，豆腐柴叶总黄酮提取液对于Fe2+螯合率高于Vit C。

图5　豆腐柴叶总黄酮对Fe2+螯合能力的影响图

3　结语

豆腐柴叶总黄酮具有较好的抗氧化活性，且随着质量浓度的增加而增大，其中对DPPH·清除率的半数抑制浓度IC50=0.070 mg/mL，过氧化氢清除率的半数抑制浓度IC50=0.011 mg/mL，对Fe3+还原能力及Fe2+螯合能力均有较好的线性关系，使用超声波提取的豆腐柴叶总黄酮的总抗氧化能力较强。

参考文献:

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[5]朱会霞.覆盆子黄酮抗氧化活性研究[J].现代食品科技，2012，28（10）：1302-1305.

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[7]周劝娥，田呈瑞，关 为，等.陕西苦菜叶总黄酮的提取及抗氧化活性的测定[J].食品工业科技，2013，34（9）：97-102.

[8]王 静.刘大川.紫(白）苏叶黄酮类化合物抗氧化性能的研究[J].中国油脂，2004，29（3）：33-36.

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[10]曾林晖，邓泽元，余修亮，等.蜂胶黄酮的超声波提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2016，37（12）：297-300.

[11]段宙位，李维国，窦志浩，等.沉香叶黄酮化合物的提取及其抗氧化活性[J].食品科学，2015，36（6）：45-50.

[12]Hinneburg I.，Dorman H J D.，Httunen R. Antioxidant activities of extracts from selected culinary herbs and spices[J].Food Chemistry，2006（97）：122-129.