健康人外周血白念珠菌烯醇化酶抗原特异性T细胞检测*

蒋曦旻，张　斌，史利宁，商秀娟，张彩云，王静瑜，胡毓安

(1.中国人民解放军南京总医院a.医学信息科；b.临床中心实验科，南京　210002； 2.南京大学医学院附属鼓楼医院药学部，南京　210008)

近二十年来，在ICU病人和免疫抑制患者(如艾滋病、临床恶性肿瘤、器官移植患者)中，侵袭性念珠菌病(invasive candiasis，IC)感染率逐年增高。受限于缺少特异临床症状和早期实验室诊断指标，IC死亡率高达40%～50%，临床结局并未获得明显改善[1]。免疫辅助治疗和预防接种被认为可能是将来改善IC临床治疗结局的有效策略[2]，寻找有效的念珠菌疫苗分子是目前的研究热点之一。

白念珠菌烯醇化酶(enolase，Eno)由440个氨基酸组成，分子量在45～48 kD之间，是白念珠菌中含量最丰富的可溶性蛋白之一。Eno催化糖酵解过程中2- 磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸，并在糖异生过程中催化逆向反应，参与念珠菌的能量代谢。Eno定位于白念珠菌细胞壁和胞浆内，白念珠菌出现菌丝相生长时Eno表达显著增多，提示Eno与侵袭性感染相关[3]。白念珠菌Eno具有强免疫原性，在IC病人体内可检出高滴度的抗Eno- IgG抗体，并可引起细胞免疫应答[4～6]。动物实验的研究结果表明，Eno抗体对IC可以提供保护性作用[7～10]，因此Eno被认为是一个具有研究价值的IC疫苗候选分子。

酶联免疫斑点技术(ELISPOT)具有高敏感度(可以检出1/105细胞)和高特异度，可以在单细胞水平测定抗原特异性T淋巴细胞分泌细胞因子的功能和数量，适用于特异性T细胞应答的测定，客观反映免疫细胞的应答规律，被广泛应用于疫苗机制研究和疫苗效应评价。本研究采用实验室自制的Eno基因重组抗原，通过建立ELISPOT方法检测健康人外周血单个核细胞(PBMC)中分泌干扰素- γ(IFN- γ)，白介素- 4(IL- 4)与白介素- 17A(IL- 17A)的Eno抗原特异性T淋巴细胞频数，分析健康受试者PBMC在其刺激下产生的细胞免疫应答类型，以了解Eno抗原特异性T 淋巴细胞在IC中是否具有提供细胞免疫保护作用的可能性。

1　材料与方法

1.1研究对象选取南京军区南京总医院生殖中心门诊男性健康体检者25例，年龄25～48岁(31.64±5.25岁)。

1.2试剂与仪器Eno重组抗原由本课题组自制，ELISPOT试剂(mabtech公司)，PVDF板(Milipore公司)，RPMI1640培养液、EZ- Culture无血清培养液和全套人ELISPOT辅助试剂盒(深圳达科为公司)，Ficoll淋巴细胞分离液(上海华精生物公司)，Biosys Bioreader 4000 PRO斑点分析仪及分析软件均为深圳市达科为生物技术有限公司提供。

1.3方法PBMC分离和分泌IFN- γ，IL- 4和IL- 17A的Eno- 特异性淋巴细胞频数检测，按说明书和文献进行操作[11]。无菌条件下细胞培养时每孔先后加入细胞悬液100 μl(浓度为2×106/ml)和刺激物10 μl。特异性抗原刺激物为Eno抗原(10 μg)，阳性对照孔的刺激物为PHA，阴性对照孔的刺激物为无血清培养液，试剂对照孔加EZ- Culture无血清培养液，不加入刺激物。每份标本设3个复孔。每次检测同时设2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个试剂对照孔，阴、阳性对照孔细胞浓度为2×105细胞/孔，检测抗体浓度分别为：IFN- γ：1 μg/ml，IL- 4：1 μg/ml和IL- 17A：0.5 μg/ml。

1.4统计学分析使用SPSS 18.0软件对实验结果进行统计学分析。偏态分布的计量资料用中位数(四分位数)[M(P25，P75)]表示，计数资料用频数、百分数表示。偏态分布的计量资料多组间比较用Kruscal- Wallis法，如各组间有显著性差异，进一步采用Mann- WhitneyU检验进行两组间比较，采用Bonferroni法校正P值判断有无显著性差异。计数资料组间比较采用Fisher’s exact test检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Eno抗原特异性T淋巴细胞分泌IFN- γ，IL- 17A和IL- 4的阳性斑点形成细胞(SFC)ELISPOT检测结果见图1。Eno刺激后，分泌IFN- γ，IL- 4和IL- 17A的抗原特异性T淋巴细胞频数分别为14.00(8.5，39.00)个、0(0，0)个和2(1，4.5)个，Kruscal- Wallis法显示三组间SFC差异具有统计学意义(χ2=60.919，P=0)，随后采用Mann- WhitneyU检验进行两组间比较，发现各组间差异均有统计学显著性意义(IFN- γ vs IL- 17A：U=35.5，IFN- γ vs IL- 4：U=0，IFN- γ vs IL- 4：U=41.0，均P<0.01)，见图2。Eno刺激后产生强IFN- γ应答(SFC≥20)的健康人占40.00%(10/25)，无受试者产生强IL- 17A和IL- 4应答。

图1　重组人Eno刺激健康人PBMC产生的细胞

2.2Eno抗原特异性T淋巴细胞免疫应答模式分析Eno刺激后，25例健康受试者分泌IL- 4，IL- 17A和IFN- γ的应答率分别为4%(1/25)、88%(22/25)和100%(25/25)，IFN- γ和IL- 17A应答率均高于IL- 4，差异具有统计学意义(均P<0.01)，见图3。健康受试者PBMC细胞免疫应答模式以同时产生Th1和Th17型应答为主，占84%(21/25)；3例研究对象仅产生Th1型细胞免疫应答(12.00%，3/25)，4%(1/25)同时产生Th1，Th2和Th17型3种细胞免疫应答，未观察到单独产生Th2型或Th17型细胞免疫应答者，见图4。

图2　IFN- γ，IL- 4和IL- 17A的频数比较

图3　IFN- γ，IL- 4和IL- 17A应答阳性率

图4　健康人对白念珠菌Eno的细胞免疫应答类型

3　讨论

白念珠菌是常见的院内血流感染病原菌[1]，目前IC不断升高的感染率和居高不下的死亡率[12]，使得学者们不断寻找可以改善IC治疗结局的新策略，比如免疫辅助治疗和预防接种。而寻找理想的念珠菌保护性疫苗分子并阐明其保护机制是IC疫苗研发领域的热点[2]。

Eno是念珠菌能量代谢的重要酶类[5]，其表达水平和白念珠菌侵袭性生长相关[3]，被认为可能是IC的诊断标志物[5，6]，因此，Eno是IC诊断、治疗和预防研究中的一个热门分子。在IC感染过程中，白念珠菌Eno及其重组蛋白均被证实具有较强的免疫原性，可以引发人体和实验动物产生强烈的体液免疫应答。如血清蛋白质组学分析显示，IC病人血清中存在高滴度的抗Eno- IgG[5，6]，重组Eno免疫小鼠和家兔，均能产生高滴度的抗Eno- IgG。动物模型的研究结果显示，Eno在念珠菌感染过程中诱导产生的抗体具有保护作用。重组Eno或Eno近N端14个氨基酸多肽免疫后的小鼠对致死性念珠菌血流感染具有抵抗力，其肾脏、肝脏、脾脏、脑等器官真菌载量下降，小鼠生存期延长。在对实验小鼠实施致死剂量白念珠菌的静脉注射前，被动转移抗Eno- IgG抗体、抗Eno单抗或Eno免疫后动物血清，观察到实验小鼠脏器真菌载量明显降低甚至完全清除，可显著提高小鼠生存率[4，7，10]。可能由于研究所采用的小鼠品系、白念珠菌感染菌株和免疫方案不同，尽管有研究认为Eno对IC的保护效果为中等，但Eno仍被认为是一个有潜力的疫苗分子。

Li等[7]发现Eno- IgG通过抗体介导的调理作用促进吞噬细胞清除和中性粒细胞对白念珠菌的杀伤实现保护作用。Montagnoli等[4]用重组Eno联合IL- 12佐剂免疫B细胞缺陷的BALB/c b- /b- 小鼠，在这种不能产生抗体的小鼠品系中也观察到了与野生型小鼠类似的保护作用，他们进一步用Eno或热灭活的白念珠菌刺激Eno免疫后小鼠CD4+T细胞，检测到细胞培养上清中Th1型细胞因子IFN- γ和IL- 2分泌增多，因此他们认为Eno的保护作用是通过细胞免疫功能发挥的。这些实验结果提示Eno对IC的保护作用机制可以通过体液免疫和细胞免疫作用单独或共同实现。

在某种抗原刺激下，机体内针对该抗原的特异性T淋巴细胞克隆会发生活化和扩增，ELISPOT 技术可通过检测活化后抗原特异性T淋巴细胞所分泌的特定细胞因子，直观地反映T细胞的免疫反应类型，并具有较高的灵敏度及特异度，可弥补ELISA检测血清或培养上清中细胞因子的含量时，易受其半衰期、代谢等因素的影响，且无法精确估算分泌细胞因子的T细胞数量的缺点。本研究证实，在健康人群中普遍存在白念珠菌Eno抗原特异性T淋巴细胞克隆，白念珠菌Eno在健康人群中可引起细胞免疫应答，细胞免疫应答类型以Th1型和Th17型为主，几乎不引起Th2型应答。

在机体抵御白念珠菌感染中，由Th1和Th17细胞亚群介导细胞免疫发挥了重要的保护性作用[13]。Th1细胞亚群通过分泌IFN- γ，IL- 2，IL- 12和TNF- β等细胞因子，促进中性粒细胞和吞噬细胞募集和激活，发挥吞噬和清除念珠菌的活性；Th17细胞亚群可以分泌IL- 17A，通过募集中性粒细胞至感染部位和上调抗微生物多肽表达发挥抗念珠菌活性；Th2细胞亚群分泌IL- 4，IL- 5和IL- 10等细胞因子，可抑制Th1细胞和吞噬细胞活性，诱导吞噬细胞的不完全吞噬，降低对念珠菌的抵抗力；还可通过上调精氨酸酶1活性，降低具有抗真菌活性的NO水平[2，14]，此外Th2细胞应答还与病理免疫应答相关。本研究结果显示，经Eno刺激后，健康受试者PBMC中IFN- γ和IL- 17A的应答率和SFC频数均显著高于IL- 4(P均=0)，84%(21/25)的受试对象PBMC同时产生Th1型和Th17型细胞免疫应答，12%(3/25)的研究对象仅产生Th1型细胞免疫应答，1例受试者(4%，1/25)同时产生Th1，Th2和Th17型三种细胞免疫应答，未观察到单独产生Th2型或Th17型细胞免疫应答者。其中Eno刺激后产生强IFN- γ应答(SFC≥20)的健康人占40.00%(10/25)，无人产生强IL- 17A和IL- 4应答。说明白念珠菌Eno引起机体PBMC产生的细胞免疫应答以保护性的Th1型和Th17型应答为主，几乎不引起对IC易感的Th2应答。结合以往白念珠菌Eno引发强烈的体液免疫应答研究结果，我们认为Eno暴露于机体免疫系统后，既可以产生保护性的体液免疫应答，也可以产生保护性的细胞免疫应答，提示Eno是一个理想的IC疫苗分子。

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