NMBS- TRFIA法检测血清S100A11对胰腺癌的诊断价值*

黄书明，吴玉兰，江　枫，倪温慨，管程齐，陆翠华，肖明兵

(1.南通市第三人民医院，江苏南通　226006；2.南通大学附属医院，江苏南通　226006)

血清标志物是提高胰腺癌的早期诊断水平最易推广应用的方法，但目前临床上常用的胰腺癌诊断标志物CEA，CA19- 9，CA50等传统血清标志物的特异度和敏感度均较低，其临床诊断价值有限。钙囊素(S100A11)是具有EF手型的S100钙连接蛋白家族重要成员之一[1]，其在胰腺癌组织中表达上调[2]，提示其对胰腺癌具有早期诊断价值[3]。本研究首次构建纳米磁珠分选联合时间分辨免疫荧光测定(nanomagicbeabs sorting- time resolved fluoroimmuno assay，NMBS- TRFIA)检测血清S100A11，同时探讨其对胰腺癌的诊断价值。

1　材料与方法

1.1研究对象为南通大学附属医院住院患者，其中胰腺癌88例，男性49例，女性39例，中位年龄57岁；胰腺囊肿10例，男性5例，女性5例，中位年龄50岁；急性胰腺炎50例，男性27例，女性23例，中位年龄52岁。所有病例均经临床和(或)病理学证实。以体检健康者20例作为正常对照，男性11例，女性9例，中位年龄51岁。均在治疗前采集清晨空腹静脉血8 ml，分离血清后置-80℃冰箱保存备用。

1.2试剂和仪器本研究所需试剂为：西安金磁纳米生物科技有限公司提供的GoldMag○R- CS纳米金磁微粒(30 nm)蛋白偶联试剂盒，美国SantaCruz公司提供的S100A11鼠抗人单克隆抗体和S100A11羊抗人多克隆抗体及美国PE公司提供的Eu- labeled streptavidin。本研究所需仪器为：美国PE公司提供的VICTOR X5时间分辨免疫荧光器。

1.3方法采用GoldMag○R- CS纳米金磁微粒(30 nm)蛋白偶联试剂盒将经2次偶联液预处理的GoldMag○R- CS纳米金磁微粒与偶联抗体S100A11鼠抗人单克隆抗体37℃，180 r/min振荡偶联20 min；封闭液封闭后加入待测血清(或S100A11标准蛋白)37℃反应1 h，磁性分离2 min，然后将待测血清全部取出后冻存；分离后的磁珠经洗涤后加入生物素标记的S100A11羊抗人多克隆抗体置37℃，1 h；磁性分离后弃去检测抗体，洗涤后加入Eu- labeled streptavidin 37℃避光，1 h；磁性分离洗涤，加入增强液反应后移于96孔检测板，以时间分辨免疫荧光器(TRFIA)于激发波长337 nm、发射波长615 nm测各孔荧光值。根据标准曲线计算样本S100A11浓度。

2　结果

2.1纳米磁珠分选- TRFIA检测S100A11方法的建立30 nm粒径的超顺磁性复合微粒，其核为纳米磁性粒子，核表面是金的壳层，不需共价耦联试剂，可成功将S100A11抗体耦联在纳米金磁微粒表面，耦联有S100A11抗体的纳米金磁微粒可以从血清中分离出S100A11。该法检测系列稀释S100A11标准蛋白，在6.08～500 ng/ml范围内呈线性关系，见图1，批内CV≤6.35%，批间CV≤7.12%，平均回收率为104.7%。

图1　NMBS- TRFIA法检测S100A11的剂量- 反应曲线

2.2各组血清S100A11水平比较胰腺癌、急性胰腺炎、胰腺囊肿S100A11水平分别为185.53±161.19，106.06±113.83，68.99±47.83 ng/ml，与正常对照组(37.98±25.14 ng/ml)比较，差异均有统计学意义(t=-8.065，-3.375，-2.266，均P<0.01)。

2.3S100A11对胰腺癌的诊断价值以胰腺囊肿组、急性胰腺炎组和正常对照组为参照，做S100A11的ROC曲线。ROC曲线下面积AUC=0.985(95%CI：0.972～0.997)，根据ROC曲线计算得到S100A11诊断胰腺癌的最佳界值为89.5 ng/ml(敏感度81.8%，特异度67.5%)。以S100A11浓度89.5 ng/ml为诊断界值时，胰腺癌、急性胰腺炎、胰腺囊肿患者及健康者的阳性率分别为81.8%(72/88)，46.0%(23/50)，20.0%(2/10)，5.0%(1/20)，对胰腺癌的诊断敏感度显著高于其它3组(P均<0.01)。见图2。

图2 S100A11诊断胰腺癌的ROC曲线图

3　讨论

胰腺癌是胰腺恶性肿瘤中最常见的一种，5年存活率仅3%～5%[4]，85%的患者出现症状时已发生淋巴结或远处转移，放化疗等综合治疗对改善患者的存活效果甚微[5]。因此，寻找具有较高敏感度和特异度的胰腺癌血清标志物对胰腺癌的早期诊断具有非常重要的意义。研究发现，S100A11与多种肿瘤的形成和进展具有一定的相关性，如胰腺癌、胃癌、肝癌、食管癌、肺癌、大肠癌等[6～9]。

时间分辨免疫荧光是一种具有敏感度高、特异度强、稳定性好的定量检测方法[10]。纳米磁珠兼具高分子粒子和磁性粒子的特性，具有固定效率高、易于磁性分离及生物相容性好等特点，同时大大简化实验流程、缩短测试周期、明显提高检测敏感度[11]，可应用于蛋白质、DNA，病毒的检测。本研究首次构建NMBS- TRFIA法检测血清S100A11水平，先采用抗体耦联的纳米磁珠进行分选，从体积较大的标本中(如500 μl)富集筛选出目的蛋白，并重新释放到微小体积的检测液中(如5 μl)，使得样本一次浓缩100倍，从而大大提高了检测敏感度。该法的平均回收率高，批内、批间差异小，表明该法具有较好稳定性及重复性。因此，应用NMBS- TRFIA法检测血清S100A11浓度值得在临床推广。

针对现阶段小学数学教学情境教学存在的问题，教育工作者应当从自身与教学方法两个方面进行改进与反思，寻求更加有效地对情境的应用对策，提高教学的质量。本文从三个方面具体的探究了小学数学教学中情境教学的对策。

本研究发现，胰腺癌中S100A11水平明显高于急性胰腺炎、胰腺囊肿及正常人群。以89.5 ng/ml为诊断界值时，敏感度81.8%，特异度67.5%，胰腺癌的阳性率也显著高于急性胰腺炎、胰腺囊肿患者及正常人群，说明S100A11是胰腺癌的早期诊断标志物之一，与文献报道一致[2，12]。

综上所述，血清S100A11诊断胰腺癌具有较高的敏感度和特异度，是一种诊断早期胰腺癌的新型血清标志物。NMBS- TRFIA检测方法的应用，在初步实现了对患者血清重复利用的同时，提高了检测敏感度，为临床的肿瘤标志物检测和TRFIA高通量检测提供了新方法。

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