铜藻海藻酸钠复合鲅鱼糜保水剂的制作优化

2018-04-12王其东付晓婷许加超毛相朝

中国渔业质量与标准 2018年2期

王其东，付晓婷，许加超，毛相朝

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003)

鱼糜的保水性是指在鱼糜加工过程中，鱼糜的水分及添加到鱼糜中的水的保持能力[1]。保水性是评价鱼糜品质的重要指标，保水性的高低直接关系到鱼糜的质地、风味和出品率。鱼糜保水剂是一类重要的肉制品品质改良剂，传统的鱼糜保水剂主要是多聚磷酸盐，能够有效地提高产品的嫩度，改善质地和风味，具有较好的保水性能，在食品工业中被广泛应用[2-3]。然而，由于磷酸盐容易水解，难以持久保持良好的保水效果。另外，添加过量的磷酸盐又会导致产品出现令人不愉快的金属涩味，并且容易导致鱼糜出现质地粗糙、表面“晶化”等现象[4]。因此，亟待研制出一种保水效果优良持久且能够减少磷酸盐的使用量或者是取代磷酸盐的新型鱼糜保水剂。

近年来，国内学者陆续研究开发了以内脏水解蛋白酶[5]、谷氨酰胺转氨酶[6]、海藻酸钠[7]等为主要成分的复合型保水剂。海藻酸钠有“长寿食品”之称，是一种从褐藻细胞壁中提取得到的，通常根据其分子量不同而应用在不同的领域，在大分子状态下往往利用其较高的黏度和稳定性，广泛应用于食品、医药、印染等领域[8-9]。然而，市售海藻酸钠来源单一，主要是从海带中提取的，从其他褐藻中提取的海藻酸钠，研究其应用的还较少。

铜藻(Sargassumhorneri)属于暖温带大型褐藻，中国辽宁、浙江、福建、广东等沿海地区都有分布，来源广泛，不仅是藻胶工业的优质原料，在医药、食品、饲料行业中也被广泛应用，具有较高的商业价值。其中，褐藻胶含量大约22%，含量丰富。在食品工业中，海藻酸钠主要被用作稳定剂、增稠剂，研究主要集中在生物可降解保鲜膜[10]、载药微球[11-12]、肉和果蔬保鲜[13]等方面。然而，从铜藻中提取出的海藻酸钠只见有用于烟丝的保润[14]，用于鱼糜保水的研究应用尚未见报道。

本研究采用从铜藻中提取的海藻酸钠，以传统的多聚磷酸盐(六偏磷酸钠、三聚磷酸钠、焦磷酸钠)、大豆分离蛋白和谷氨酰胺转氨酶为原料，通过单因素和正交实验优化原料配比，以期研制开发出配置合理且稳定性良好的新型复合型保水剂，从而解决磷酸盐作为保水剂超标的问题，同时丰富鱼糜保水剂的多样性。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

实验材料为新鲜鲅(Spanishmackere)购于青岛水产市场和铜藻购于浙江舟山。实验试剂有海带海藻酸钠(化学纯)、六偏磷酸钠、三聚磷酸钠、焦磷酸钠、磷酸三钠、大豆分离蛋白和谷氨酰胺转氨酶，均为食品级添加剂。

1.2　主要仪器设备

主要仪器包括高效液相色谱仪(1260，Agilent公司)；増力电动搅拌器(JJ-1，上海双捷实验设备有限公司)；超滤杯(MSC50，上海摩速科学器材有限公司)；紫外分光光度计(UV-2550，SHIMADZU公司)；旋转粘度计(NDJ-1，上海平轩科学仪器有限公司)；质构仪(TMS-Pro，FTC公司)；数显恒温水浴锅(DK-8D，金坛瑞华仪器有限公司)；冷冻干燥机(FD5-4，GOLD SIM公司)；电子天平(PL202-S，Mettler Toledo公司)；-20 ℃冰箱(海尔集团)；超低温冰箱(海尔集团)。

1.3　实验方法

1.3.1海藻酸钠的提取纯化、结构分析和性能测定

1.3.1.1工艺流程

干铜藻→预处理(料液比1∶25，浸泡2 h)→1.00%甲醛(m/m)固色→清洗→2.00%Na2CO3(m/V)60 ℃消解3.0 h→过滤→清胶液→H2O2漂白[15]→酸沉(至pH 3.0)→醇沉→中和转化(40.00% NaOH 调pH至8.0，保持40 min)→乙醇清洗→ 60 ℃烘干→粉碎→铜藻海藻酸钠。

1.3.1.2分离纯化

将铜藻海藻酸钠粉末溶解于去离子水后，在50 ℃条件下，持续搅拌，自然冷却，静置脱气[16]。先用3 μm滤膜抽滤，去除部分杂质，再用超滤杯进行过滤，使用50 kDa滤膜，将铜藻海藻酸钠分为分子量50 kDa以上和50 kDa以下两部分，分别冻干、备用。

1.3.1.3分离纯化后的海藻酸钠分子量分布表征

参照参考文献[17-18],通过分子筛色谱柱对分离纯化后的50 kDa以上和50 kDa以下两部分海藻酸钠分子量保留时间进行表征。主要仪器参数为：色谱柱TSK-gel G3000 SWXL(7.80 mm×300 mm)，检测器示差折光检测器(RID)；流动相0.20 mol·L-1NaCl；流速0.50 mL·min-1；柱温40 ℃。取20 μL 1.00 mg·mL-1海藻酸钠上样测定。

1.3.1.4紫外光谱定性分析

称取0.50 mg新提取的铜藻海藻酸钠溶于1mL蒸馏水中，制得0.50 mg·mL-1铜藻海藻酸钠溶液。用岛津UV-2550紫外分光光度计对溶液进行光谱扫描，扫描范围190～400 nm，测定特征吸收峰值。

1.3.1.5傅里叶变换红外光谱分析

取1.00 ～2.00 mg的铜藻海藻酸钠粉末、海带海藻酸钠粉末、分子量大于和小于50 kDa铜藻海藻酸钠粉末，分别加入100.00 mg KBr，于玛瑙研钵中研磨，压片至透明后，置于红外光谱仪在4 000～400 cm-1进行扫描，分析铜藻海藻酸钠的分子结构构成。

1.3.1.6黏度和质构测定

黏度测定[19]：配制1%海带海藻酸钠(m/V)和铜藻海藻酸钠溶液，在20 ℃条件下，利用NDJ-1型旋转黏度计分别测量黏度。

质构测定：将3%海带海藻酸钠(m/V)和铜藻海藻酸钠溶液分别置于5%CaCl2(m/V)溶液，于50 ℃条件下交联4.5 h；形成凝胶后切成相同的长方体，用质构仪进行测定硬度、弹性、胶黏性、咀嚼性和凝胶强度。

1.3.2保水性能测定

1.3.2.1保水剂添加及鱼糜冻藏

将采购的新鲜鲅，去头、去内脏、去尾、去结缔组织，清洗，取背部白色肉打碎成鱼糜，密封后置于4 ℃冰箱中备用。

称取10.00 g鱼糜，将保水剂按一定量添加到鱼糜中，混合均匀后，装入自封袋，密封。置于超低温冰箱快速冻结后，转放入-20 ℃冰箱中冻藏24 h。

1.3.2.2解冻损失率测定

取出冷冻的鱼糜，称其质量B1，将其置于室温解冻，用滤纸吸出解冻沥出的水分，称其质量B2。

1.3.2.3蒸煮损失率测定

参照参考文献[20]，将解冻沥水后的鱼糜放于80 ℃水浴锅中加热20 min，取出后用滤纸吸出蒸煮出来的水分，称其质量B3。

1.3.2.4解冻蒸煮损失率测定

1.3.3新型复合保水剂制取工艺优化

1.3.3.1单因素和正交实验

分别考察不同含量水平的焦磷酸钠、三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、谷氨酰胺转氨酶、大豆分离蛋白、铜藻海藻酸钠、海带海藻酸钠、分子量大于和小于50 kDa铜藻海藻酸钠对鲅鱼糜解冻损失率和蒸煮损失率的影响。根据单因素实验结果，选取六偏磷酸钠、三聚磷酸钠、谷氨酰胺转氨酶和铜藻海藻酸钠4种添加剂为相应变量，设计了四因素三水平正交实验方案，对复合型添加剂用量进行优化。

1.3.3.2不同保水剂对比实验

将经正交实验优化确定的复合保水剂与已报道复合磷酸盐添加剂的解冻损失率、蒸煮损失率和解冻蒸煮损失率进行比较，验证新配制铜藻海藻酸钠复合保水剂的保水效果，对照组为不添加任何保水剂的鲅鱼糜。

1.4　统计方法

进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，以及最小显著差异法分析(LSD)，统计软件用SPSS 17.0，P<0.05呈显著性影响。

2　结果与讨论

2.1　铜藻海藻酸钠分析

2.1.1纯化后海藻酸钠分子量的HPLC表征

分子量大小不同导致海藻酸钠的保留时间不同，由图1可知，分子量大于50 kDa的铜藻海藻酸钠保留时间为11.09 min，分子量小于50 kDa的铜藻海藻酸钠保留时间为12.32 min，可以看出，使用超滤方法可以达到分离的目的。

2.1.2结构分析

图2是对铜藻海藻酸钠(纯度>98.00%)结构分析的结果。由图2(a)可以看出，在260 nm和280 nm左右均无特征吸收峰，说明本实验从铜藻中提取的海藻酸钠不含有蛋白质、核酸类物质[21]，因此，纯化时无需进行去除蛋白质、核酸的操作。图2(b)中，I、II分别代表分子量小于50 kDa、分子量大于50 kDa的铜藻海藻酸钠，III、IV分别代表铜藻海藻酸钠和海带海藻酸钠。图2(b)表明，这4种海藻酸钠红外光谱都具有以下6个特征吸收峰[22-23]： 1) 3 481 cm-1，为分子内或分子间氢键缔合O-H伸缩振动； 2) 2 936 cm-1，为-CH-基团的伸缩振动； 3) 1 608 cm-1，为羧基-COO-上非对称伸缩振动； 4) 1 419 cm-1，为C-H的弯曲振动引起的； 5) 1 300～1 000 cm-1，为C-O伸缩振动引起的，归属于C-O-H，糖苷键C-O-C，证明了羧基的存在； 6)789 cm-1和808 cm-1，分别为多聚L-古罗糖醛酸和多聚D-甘露糖醛酸的特征吸收峰。位于789 cm-1的古罗糖醛酸(G)和位于808 cm-1的甘露糖醛酸(M)特征吸收峰的大小与G/M比值的大小有关。从图2中，可看出海带海藻酸钠的G/M值比其他3种海藻酸钠的G/M值小，说明铜藻海藻酸钠具有更强的刚性，有利于海藻酸钠形成以弹性为主的凝胶性质[24-25]。

图1　海藻酸钠分子量的表征Fig.1 Characterization of sodium alginate molecular weight

图2　铜藻海藻酸钠全波长紫外扫描光谱图(a)和红外光谱图(b)I:分子量小于50 kDa铜藻海藻酸钠；II:分子量大于50 kDa铜藻海藻酸钠；III:铜藻海藻酸钠；IV:海带海藻酸钠。Fig.2 (a) Full wavelength scanning spectrum of Sargassum horneri sodium alginate and (b)The infrared spectra of sodium alginate.I: Molecular weight less than 50 kDa Sargassum horneri sodium alginate; II:Molecular weight more than 50 kDa Sargassum horneri sodium alginate; III: Sargassum horneri sodium alginate; IV: Laminaria japonica sodium alginate.

2.1.3质构分析

表1质构分析结果表明，铜藻海藻酸钠的弹性和凝胶强度均较海带海藻酸钠的高，但是差异不显著(P>0.05)；硬度低于海带海藻酸钠，差异较为显著(P<0.05)；铜藻海藻酸钠胶黏性和咀嚼性显著低于海带海藻酸钠(P<0.05)。铜藻海藻酸钠溶液的黏度为168.50 mPa·s，明显高于海带海藻酸钠的130.30 mPa·s(P<0.05)，有助于鱼糜的保水。

表1　海藻酸钠的质构分析结果Tab.1　Results of texture analysis of alginate　n=3

注：表中*代表同列数据差异显著(P<0.05)。

2.2　单因素实验结果

2.2.1焦磷酸钠添加量对鱼糜保水性的影响

从图3可以看出，鲅鱼糜中加入焦磷酸钠后，其解冻损失率几乎不受焦磷酸钠添加量的影响。与对照组相比，焦磷酸钠显著地降低了鱼糜的蒸煮损失率(P<0.05)，蒸煮损失率随焦磷酸钠添加量的增加而明显降低，在焦磷酸钠添加量大于0.15%时，下降趋势变缓，差异并不明显(P>0.05)，因此焦磷酸钠的添加量可以选择0.05%～0.15%。

图3　焦磷酸钠添加量对鲅鱼糜解冻损失率和蒸煮损失率的影响(n=3)“*”表示与对照组相比，差异性显著(P<0.05)，图3～图7。Fig.3 Effects of addition of sodium pyrophosphate on thawing loss rate and cooking loss rate of surimi(n=3)“*”shows significantly different from the control group,the same form Fig.3 to Fig.7.

2.2.2三聚磷酸钠添加量对鲅鱼糜保水性的影响

由图4可知，三聚磷酸钠的添加量对鲅鱼糜的解冻损失率影响并不显著(P>0.05)，其中当添加量为0.15%时，解冻损失率达到最低点，与对照组相比差异显著(P<0.05)。而随着添加量的增加，蒸煮损失率呈现出明显的先降低后升高的趋势，与对照组相比蒸煮损失率均显著地降低(P<0.05)，当添加量为0.15%时，蒸煮损失率最低。因此，三聚磷酸钠的添加量选择0.15%。

图4　三聚磷酸钠添加量对鲅鱼糜解冻损失率和蒸煮损失率的影响(n=3)Fig.4 Effects of addition of sodium tripolyphosphate on thawing loss rate and cooking loss rate of surimi(n=3)

2.2.3六偏磷酸钠添加量对鲅鱼糜保水性的影响

六偏磷酸钠显著地降低了鲅鱼糜的解冻损失率(P<0.05)，然而，随着添加量大于0.05%，添加量对解冻损失率并没有显著影响(P>0.05)。从图5可以看出，添加量大于0.10%，蒸煮损失率与对照组相比均显著降低(P<0.05)，随着六偏磷酸钠添加量的增加，蒸煮损失率下降开始变缓，当添加量达到0.20%时，蒸煮损失率降到最低点，而添加量0.10%时鲅鱼糜的蒸煮损失率与0.20%时的蒸煮损失率相差不到0.50%，没有明显差别(P>0.05)，因此0.10%～0.20%是一个最优的添加量区间。

2.2.4谷氨酰胺转氨酶添加量对鲅鱼糜保水性的影响

图6结果表明，与对照组相比，谷氨酰胺转氨酶显著降低了解冻损失率，但是，随着谷氨酰胺转氨酶添加量的增加，鱼糜的解冻损失率同样没有发生明显的变化(P>0.05)，当添加量为0.20%时，解冻损失率相对较小。然而，鲅鱼糜的蒸煮损失率是随着谷氨酰胺转氨酶添加量的增加呈现出先增加后降低的趋势，添加量为0.60%时，蒸煮损失率最大。即使当添加量达到1.00%时，鲅鱼糜的蒸煮损失率仍然较高。因此，0.20%是一个合适的添加量。

图5　六偏磷酸钠添加量对鲅鱼糜解冻损失率和蒸煮损失率的影响(n=3)Fig.5 Effects of addition of sodium hexametaphosphate on thawing loss rate and cooking loss rate of surimi(n=3)

图6　谷氨酰胺转氨酶添加量对鲅鱼糜解冻损失率和蒸煮损失率的影响(n=3)Fig.6 Effects of addition of glutamine transaminase on thawing loss rate and cooking loss rate of surimi(n=3)

2.2.5大豆分离蛋白添加量对鲅鱼糜保水性的影响

由图7可知，鲅鱼糜的解冻损失率和蒸煮损失率均随着大豆分离蛋白添加量的增加而一直降低，考虑到大豆分离蛋白添加量的增加会导致鱼糜硬度的增加，并且在添加量为2.00%～3.00%之间，解冻损失率和蒸煮损失率均变化缓慢(P>0.05)，因此，添加量选用2.00%较好。

图7　大豆分离蛋白添加量对鱼糜蒸煮损失率和解冻损失率的影响(n=3)Fig.7 Effects of addition of soy protein isolated on thawing loss rate and cooking loss rate of surimi(n=3)

2.2.6海藻酸钠添加量对鲅鱼糜保水性的影响

海藻酸钠的保水效果非常好，添加海藻酸钠作为保水剂的鲅鱼糜样品解冻后，沥不出水，解冻损失率可忽略不计。由图8(a)可知，随着海藻酸钠添加量的逐渐增加，鲅鱼糜蒸煮损失率均不断降低，在添加量大于0.40%时，变化趋势减缓，并且添加量在0.20%～0.80%之间，铜藻海藻酸钠的保水性明显较市售海藻酸钠的好(P<0.05)，这可能与两种海藻酸钠分子中G、M序列有关，铜藻属于马尾藻，其G/M值大于海带，容易形成凝胶，进而成膜起到保水作用[25]。图8(b)结果表明，分子量大于50 kDa的铜藻海藻酸钠的保水性好于分子量小于50 kDa的铜藻海藻酸钠，这是因为大分子量海藻酸钠具有更大胶黏性[24]，进而具有更好的保水性能。

2.3　正交实验结果

在单因素实验的基础上，设计了四因素三水平正交实验L9(34)，方案如表2所示。此外，根据单因素实验结果，并且考虑到磷酸盐超标和大豆分离蛋白会增加鲅鱼糜硬度，因此，每个样品均加入0.10%的焦磷酸钠与2.00%的大豆分离蛋白。

由表3可知，各因素对鲅鱼糜蒸煮损失率影响的主次顺序为：A(六偏磷酸钠)>C(谷氨酰胺转氨酶)>B(三聚磷酸钠)>D(铜藻海藻酸钠)，同时，考虑到经济因素，选取的最优组合为A3B2C3D1，即0.20%的六偏磷酸钠，0.15%的三聚磷酸钠，0.30%的谷氨酰胺转氨酶，0.40%的铜藻海藻酸钠。

图8　海藻酸钠种类(a)和分子量(b)对鲅鱼糜蒸煮损失率的影响(n=3)“*”表示相同添加量的不同种类海藻酸钠差异性显著(P<0.05)。Fig.8 (a) Effects of the kinds of sodium alginate on cooking loss rate of surimi and (b) Effects of the molecular weight of sodium alginate on cooking loss rate of surimi(n=3)“*”shows significantly different in kinds of sodium algiate at same addition content.

为了验证A3B2C3D1组合是最优的结果，将A3B2C3D1与理论上的最优组合A3B3C3D3进行了对比验证实验，得出A3B2C3D1的蒸煮损失率是7.12%，低于A3B3C3D3的蒸煮损失率7.73%，说明A3B2C3D1配比是最优的。

表2　正交实验因素水平表Tab.2　Factors and levels of orthogonal experiment

注：A为六偏磷酸钠；B为三聚磷酸钠；C为谷氨酰胺转氨酶；D为铜藻海藻酸钠，下同。

2.4　验证实验

为了验证A3B2C3D1配比(保水剂IV)的优越性，将其与文献报道的I[26]、II[27]和III(0.20%的六偏磷酸钠，0.15%的三聚磷酸钠，0.10%的焦磷酸钠)3种保水剂同时应用在鲅鱼糜中，得到鲅鱼糜的蒸煮损失率如图9所示。

以不添加保水剂的鲅鱼糜作为对照，由图9可知，保水剂IV的解冻损失率为0，显著地降低了鱼糜的解冻损失率(P<0.05)，且均小于I、II、III的解冻损失率，极大地提高了鱼糜制品的出品率。将III和IV比较，可以看出铜藻海藻酸钠使鲅鱼糜解冻蒸煮损失率降低了5.00%左右。IV的解冻蒸煮损失率也均小于对照组和前3种保水剂。由此，可以看出保水剂IV具有优越的鱼糜保水性能。

表3　正交实验结果Tab.3　Results of orthogonal test

注：Ki为每个因素下对应的水平为i的实验结果之和；k=Ki/3；R=kmax-kmin。

图9　不同保水剂的失水率(n=3)Fig.9 Comparison of different water retaining agents(n=3)

3　结论

铜藻海藻酸钠的G、M序列及比例与海带海藻酸钠不同，其G/M值大于海带中提取的海藻酸钠的G/M值，富含G的海藻酸钠更具刚性，富含M的海藻酸钠更具柔性，因此，铜藻海藻酸钠的凝胶性能优于海带海藻酸钠[25]，更易凝胶成膜，起到保水作用。并且铜藻海藻酸钠的黏度大于海带海藻酸钠，所以，更适合用于用作鲅鱼糜的保水剂。

通过正交实验优化，鲅鱼糜具有最低蒸煮损失时的各组分添加量分别为：0.20%的六偏磷酸钠，0.15%的三聚磷酸钠，0.30%的谷氨酰胺转氨酶，0.40%的铜藻海藻酸钠，0.10%的焦磷酸钠，2.00%的大豆分离蛋白。新型铜藻海藻酸钠复合保水剂的保水效果优于已报导的多种传统保水添加剂，可用于鲅及其他鱼糜制品的保水剂，丰富了鱼糜保水剂的多样性。

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