玉米种子病原菌检测法及所致主要病害概述

2018-04-11杨克泽马金慧吴之涛陈志国任宝仓

大麦与谷类科学 2018年1期

杨克泽，马金慧，吴之涛，陈志国，任宝仓

（甘肃省农业工程技术研究院，甘肃省特种药源植物种质创新与安全利用重点实验室，甘肃武威733000）

玉米（Zea maysL.）种子是各类病原物越冬越夏的重要场所，如真菌、细菌、病毒和线虫等，而真菌是危害最多的一类，尤其是有些真菌产生的毒素，如黄曲霉毒素（aflatoxin，AFB）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）、伏马毒素（fumonisin，F）、单端孢霉烯族毒素（triehotheeenes，TS）和呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）等对人畜的健康造成严重威胁[1]。在我国，针对玉米种子携带病原真菌和细菌的研究以及检测方法方面均取得了一些进展，现对我国玉米种子携带病原菌的检测方法及其引起的主要病害方面的研究进行概括和总结，对玉米种传真菌和细菌性病害提出防治建议，并对当前研究中存在的问题进行探讨，为玉米种传病害的预防提供理论依据，从而为玉米种传病害的防治提供基础资料。

1 玉米种子带菌检测方法

1.1 种带真菌检测

在我国，玉米种子带菌检测多运用常规方法。目前，种子携带真菌常规检测方法主要有肉眼观察法、PDA培养法、吸水纸法、洗涤检测法、滤纸培养基法和荧光检测法等。肉眼观察法主要是通过播种观察幼苗或直接观察种子表面带菌情况；PDA培养法是根据真菌的培养性状等特征来检测种子带菌的一种方法，有利于真菌种类的快速测定，主要用于种子内部真菌的鉴定；吸水纸法操作简单，绝大多数真菌均能在7～10 d内产孢，比用琼脂培养法检测到的真菌种类更全面；洗涤检测法用于针对某一种菌的检测，主要用来检测种子表面携带的真菌，如玉米黑粉和黑穗病，就需用洗涤法检测，取样放入小三角瓶内，并加入10 mL无菌水，振荡10 min，将厚垣孢子洗下来，再将洗涤液移入离心管内，1 000～1 500 r/min离心5 min，离心后的悬浮液置显微镜下检查，即可明确致病菌的种类和数量。周积兵用洗涤法对甘肃河西玉米制种区玉米种子进行系统检测，结果表明玉米弯孢霉叶斑病主要是由优势种新月弯孢霉（Curvularia lunata）引起的[2]；2017年胡晓芬等采用盆栽幼苗观察法和PDA培养法进行了种子表面带菌检测，还用滤纸培养基法和PDA培养法相结合进行了种内带菌检测，筛选出了2种抗性较好的玉米品种[3-4]；商鸿生等采用几种常规方法检验了玉米种子携带圆斑病菌的效果，表明吸水纸培养法简便易行，检出率高而稳定，并对带有圆斑菌的玉米种子进行连续测定，结果显示圆斑病菌在种子中能存活3年以上[5]；对玉米干腐病（Diplodia maydis），可根据菌丝体的形态、颜色进行萌芽检验，在生产上要加强检疫。罗晓杨等采用PDA平板培养法和冷冻滤纸法对不同玉米品种的24份样品进行了种子带菌检测，通过鉴定表明，冷冻滤纸法更适宜于对镰孢菌带菌率的检测，所获得的镰孢菌带菌率高于用PDA平板培养法检测到的，能更准确地反映种子被镰孢菌侵染的概率[6]。肖明纲等采用I2-ZnCl2染色方法成功检测和鉴别出玉米种子中大孢指疫霉（Sclerophthora macrospora）的菌丝体和卵孢子，该染色法为监测玉米疯顶病的传播提供了实用的技术手段[7]。

目前，国内运用分子生物学技术检测玉米种子带菌的报道较少，罗晓杨等用酶联免疫法（ELISA）测定了玉米种子中3种镰孢菌毒素的含量[6]。对其他种子携带真菌检测的分子生物学技术还有血清学检测、免疫吸附电镜法（ISEM）、小点免疫结合法（DIBA）、双扩散法（DD）、比色聚合酶联反应法（Colorimetric-PCR）等，PCR技术在种子检验中应用较多，在PCR技术的基础上还发展了一种新技术——巢式PCR技术[8]。

1.2 种带细菌的检测方法

粮食生产的第一步是获得健康的种子，但是获得健康安全的种子并不容易，研究种子病原细菌的传播方式和侵染途径可为生产健康种子提供依据。种传细菌病害检测技术包括常规检测和分子检测技术。常规检测技术包括生长检测、分离培养、致病性测定、血清学测定等；分子检测技术包括PCR、DNA探针、限制性酶切片段长度多态性（RFLP）等技术。

曹慧英等采用细菌常规分离法、Sherlock微生物鉴定系统、特异性分子检测技术，对与玉米细菌性干茎腐病相关的杂交种金玉9856及其父本PS056、母本OSL190进行了种子带菌检测，发现金玉9856和PS056种子内部带菌，获得分离物Pag1和Pag2，2个分离物对PS056均具有致病性。高文娜等建立了进出境玉米种子上玉米内州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensissubsp.nebraskensis，Cmn）的Bio-real-time PCR技术检测方法，可以应用于实际检测玉米内州萎蔫病菌[9]。杨金玲等基于纳米磁珠标记的免疫层析法，建立了快速定量灵敏检测玉米内州萎蔫病菌的层析试纸条检测方法，同时该方法可根据检测线的光学反应进行定性判断，操作简便、灵敏度高，并可根据磁信号强度定量检测实际玉米种子样品中玉米内州萎蔫病菌的浓度，为植物病原细菌的快速高效检测提供了一种新型的检测方法[10]。冯建军等将DNA染料PMA选择渗透性和实时荧光PCR特异性相结合建立了一种快速灵敏检测玉米细菌性枯萎病菌细胞活性的新方法，该方法能有效检测玉米种子中该病菌的活性[11]。孔德昭等通过菌体免疫小鼠获得高灵敏、高特异性单克隆抗体，并以此为基础建立了一种快速、灵敏的单克隆抗体双抗体夹心法检测玉米细菌性枯萎病菌，该方法对玉米细菌性枯萎病菌具有很好的特异性[12]。

2 玉米种子带菌引起的主要病害

2.1 玉米穗腐病

玉米穗腐病是由多种真菌单独或复合侵染所致，国内外报道的真菌有30多种，是一种世界性的病害，也是我国玉米生产上的重要病害[13-14]。引起穗腐病的优势病原菌主要是镰孢菌，其中我国玉米穗腐病的主要病原菌是串珠镰孢菌（Fusarium graminearum）和禾谷镰孢菌（Fusarium moniliforme）。此外，玉米穗腐病常见的病原菌还有各种色二孢菌(Diplodiaspp.)、青霉菌（Penicillium oxalicum）、稻黑孢菌（Nigrospora)、蠕孢菌(Helminthosporium)、枝孢菌(Cladosporium)、囊孢壳菌（Botryosphaeria)、丝核菌(Rhizoctonia)、曲霉菌 (Aspergillus)、根霉菌（Rhizopus）、木霉菌（Trichoderma）、链格孢菌（Alternaria alternate）、粉红聚端孢（Thichothecium rosum）等[15]。玉米穗腐病的发生和流行与气候因素、生长环境、玉米品种等有密切关系，一般早熟品种发病较重。

2.2 玉米大小斑病

玉米大斑病（Exserohilum turcicum）和小斑病（Bipolaris maydis）在玉米上常混合发生，其发生比例及危害程度因地区和年份而有很大差异，这2种病害在美国造成相当大的经济损失，后者在相当大的地区内造成30%以上的损失。近年来，玉米小斑病及大斑病在我国各个省份均有发生。2012年调查显示，吉林省玉米大斑病发生严重的地块产量损失率约为24.19%～46.15%[16]。2009—2012年甘肃省玉米大斑病和小斑病在局部地区发病较重，病株率为 83.3%和 25.6%[17-18]。

2.3 玉米茎腐病

玉米茎腐病又称玉米茎基腐病（青枯病），是全世界玉米产区发生非常普遍的病害，主要造成玉米生产后期茎秆变软、玉米穗下垂、籽粒变少而不饱满甚至倒伏，在我国已由次要病害上升为主要病害。因受地理条件及年度间气候条件影响，不同国家和地区甚至同一地区的不同年份病原菌的种类亦存在较大差异。在我国，已见报道的病原菌种类有20余种，其中真菌19种，细菌3种。广西、河北、湖北等省的主要致病菌以串珠镰刀菌为主[19]；陕西、河南、吉林省以禾谷镰刀菌为主[20]；山东省以瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）为主，常与禾谷镰刀菌进行复合侵染[21]；北京和浙江地区的病原菌为禾生腐霉菌与肿囊腐霉菌（Pythium inflatum）[22]；黑龙江省瓜果腐霉、禾生腐霉、肿囊腐霉菌和禾谷镰刀菌均有较强的致病力[23]；甘肃省玉米茎基腐病的主要致病菌是禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌[24]。据报道，玉米茎腐病在全国各玉米产区均有危害，一般发病率5%～10%，重者20%～30%，严重地块发病率高达60%以上，病株穗质量减轻19.45%，千粒质量减少14.7%，根量减少，变黑腐烂[25]。

2.4 玉米丝黑穗病

玉米丝黑穗病（Sporisorium）是玉米生产中的重要病害，种子带菌是其远距离传播、为害范围不断扩大的重要因素，在全世界玉米产区均有发生。20世纪70年代该病在我国东北、华北和西北地区大流行，1979年甘肃天水重病区接近90%的玉米地块发病。选育抗病品种使得该病得以控制。近几年来随着一些高产、优质品种大面积推广，忽视了抗病性的严格选择，该病发病区域逐渐扩大，发病逐年加重[15]。据白金凯（1994年）报道，每年在我国东北、河北、山西和广西春玉米区由该病造成的减产达30万t；2002年东北春玉米区该病又大面积发生，估计产量损失10%～15%[26]。

2.5 玉米瘤黑粉病

玉米瘤黑粉病，是由玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）引起的具有局部侵染特点的真菌性病害，可在玉米植株地上部任何幼嫩组织侵染发病，形成菌瘤消耗植株大量养分，造成严重减产，甚至绝收[27-28]。该病也是一种世界性病害，90年代以前在我国零星发病，一般不进行防治，但近几年来为害逐年加重，已成为玉米生产上的主要病害。据统计，2000—2008年甘肃省武威市制种基地玉米瘤黑粉病发病率一直递增，严重田块发病率高达98%[29]。瘤黑粉病在玉米茎部发病时可导致减产20%～40%，果穗感病时可导致减产约80%～100%。玉米瘤黑粉病成为影响玉米产量的主要因素之一[30]。

2.6 玉米圆斑病

玉米圆斑病由玉米生平脐蠕孢菌（Bipolaris zeicol）引起，主要危害玉米叶部和果穗，病原菌以菌丝体在秸秆、病残体和土壤中越冬，为翌年的初侵染源。种子也能带菌，常引起苗期发病形成苗枯，也是病害远距离传播的重要途径[31]。1926年在美国伊利诺伊州的玉米茎秆上首次发现玉米圆斑病[32]，现已在澳大利亚、巴西、加拿大、印度、新西兰、尼日利亚、日本、美国和中国等国家发生危害[33-34]。在我国，玉米圆斑病于1974年在辽宁省[35]和吉林省[31]首次发生。目前，该病已在我国的吉林、辽宁、北京、黑龙江、内蒙古、陕西、山东、甘肃、四川、贵州、云南等地方发生和为害[4]。

2.7 玉米黑束病

玉米黑束病是种子、土壤或病残体携带直枝顶孢霉菌（Acremonium strictum）使得玉米苗期与根部受到侵染而系统性发生的病害。种植感病品种是黑束病发生严重的主要原因，种子带菌是该病害远距离传播的重要途径[36]。早在1936年，Harris曾对玉米黑束病有过研究[37]，后来印度、埃及、澳大利亚、南斯拉夫等国都有发生的报道[38]。1984年玉米黑束病从南斯拉夫传入我国的甘肃和新疆,造成严重损失[39]。近20年来，黑束病在我国甘肃、陕西、山西、河南、河北及北京等省市都有为害，有的感病品种损失率达66%[40]。2016年8月份笔者调查发现，黑束病在甘肃临泽的部分品种上发病率为89%，减产65%左右。

2.8 玉米顶腐病

1933年，Edwards在澳大利亚报道了玉米顶腐病是由串珠镰孢亚粘团变种（Fusarium moniliforme）侵染所致[41]，此菌也可引起茎基腐和穗腐病。1936年，美国正式报道了此病的发生[42]；在我国，徐秀德等1998年在辽宁省阜新地区发现此病[43]，此外在我国山东、吉林、黑龙江等省也有此病发生，甘肃河西走廊的高台县2003年发生此病，造成严重减产[15]。

2.9 玉米细菌性枯萎病

玉米细菌性枯萎病（Erwinia stewartii）是全株系统性维管束病害，该病于1897年在美国纽约州首次发现，此后相继在加拿大、墨西哥、巴西、法国、菲律宾、日本和澳大利亚等国陆续发生[44]，是我国重要的外检对象。该病除种子可以带菌外，一些带菌昆虫也是很重要的传播者，如带菌玉米跳甲（Cheatocnema pulicaria）。玉米细菌性枯萎病对甜玉米危害更为严重，减产可达90%～100%[26]。在美国，1932年损失最大，1967年损失了13%，之后病情逐渐减轻，而在意大利，损失曾达到产量的40%～90%[15]。

2.10 玉米细菌干茎腐病

玉米细菌干茎腐病是由成团泛菌（Pantoea agglomerans）引起的一种新的细菌病害[45]。2006年以来，该病在新疆、甘肃等玉米制种田中连续发生，田间植株发病率为80%～100%，严重发生时甚至造成绝产[46]。种子中的病菌能够随植株的生长再度传到果穗的籽粒中，完成致病细菌从种子到种子的侵染循环。

2.11 其他玉米种传病害

玉米霜霉病和菲律宾霜霉病都是种传病害，也是我国对外检疫对象，前者是由玉蜀黍霜指霉病菌（P.sorghi）危害引起的，是东南亚国家玉米上的重要病害，在印度尼西亚严重发生年份，损失可达40%。国内云南省曾有发生，发病严重年份发病率高达61%，广西也有发生过的报道。菲律宾霜霉病是由菲律宾霜指霉（P.philippineniss）引起的，主要分布在菲律宾、印度、非洲等国家，在菲律宾所引起的减产高达40%～60%，我国云南省开远县个别晚熟田发病率达90%，国内其他地方未见发生危害的报道[15]。

3 防治措施

对玉米种传病害的防治需要多管齐下，一是加强检疫检验工作，从源头上避免或减少种子带菌。二是加强绿色防控，选用抗病品种、轮作倒茬、科学施肥和加强管理进行农业防治，也可利用一些植物提取液、生防细菌、生防真菌等来防治种传病害。三是进行适当的化学防治。播种前用32.5%苯甲·嘧菌酯、0.136%赤·吲乙·芸苔可湿性粉剂和30%丁硫克百威乳油进行种子包衣；苗期喷施50 g/L可溶性硅肥和氨基酸·锰·锌促根壮苗，提高抗病性；喇叭口期喷施可溶性硅肥750倍液、安融乐5 000倍液和0.136%赤·吲乙·芸苔5 500倍液和6%阿维·氯苯1 000倍液进行喷雾统防，主要目的是减轻病害的发生，防治玉米红蜘蛛、棉铃虫、蚜虫等虫害减轻伤口，达到防虫防病的目的；抽雄结束后综合防治，喷施240 g/L噻呋酰胺1 500倍液、32.5%苯甲·嘧菌酯2 000倍液、0.136%赤·吲乙·芸苔可湿性粉剂5 500倍液、助剂5 000倍液、氨基酸·锰·锌750倍液和四霉素1 000倍液，主要防治玉米锈病、瘤黑粉病、顶腐病、穗腐病及玉米细菌性病害等[47-48]。

4 结语

在我国，玉米种子携带病原菌检测方面的研究报道还比较少，多数采用的是常规检测法，只是对菌群进行检测鉴定，缺乏对作用机理和种子活力等方面的研究，这在今后的研究中需要加强。种传病害给玉米生产带来了严重威胁，要从源头避免或减少病原物的携带，就得抓好产地检疫和调运检疫。要抓好检疫工作就得运用一些精细准确的检测方法。就我国而言，玉米种子带菌检测方法还比较滞后，在今后应多采用和引进一些先进技术，确保玉米种子带菌检测工作的准确性，为玉米种传病害的控制提供科学依据。近年来玉米细菌性种传病害日趋严重，一旦发生，传播迅速，防治难，应引起广大植保专家、农业技术人员及检疫部门的高度重视。

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