沉默FoxM1对甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁徙及侵袭的影响

刘千玉，张国志，田炜，詹琪琪，陈建立，陈俊卯，曹文斌

(1华北理工大学附属医院，河北唐山 063000；2华北理工大学实验研究中心)

叉头框转录因子M1(FoxM1)在很多恶性肿瘤中表达升高，如宫颈癌[1]、胰腺癌[2]、结肠癌[3]及胃癌[4]等，提示FoxM1在肿瘤生长过程中扮演重要角色，但目前FoxM1蛋白在甲状腺乳头状癌中表达及其相关研究较少。2017年6～10月，我们通过脂质体LipofectamineTM2000转染FoxM1的siRNA,观察其对人甲状腺乳头状癌细胞株K1增殖、迁徙及侵袭的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料人甲状腺癌细胞株K1购自上海细胞库，由华北理工大学中心实验室保存。FoxM1-siRNA靶向序列正向引物为5′-GCUGGGAUCAAGAUUAUUATT-3′，反向引物为3′-UAAUAAUCUUGAUCCCAGCTT-5′，由苏州吉玛基因股份有限公司合成，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，RPMI1640培养基、青链霉素、新鲜胚胎牛血清、PBS缓冲液及胰蛋白酶均购自以色列BI公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，Matrigel胶购自BD公司，噻唑蓝(MTT)购自美国Amereco公司。

1.2人甲状腺癌细胞株K1的培养及传代人甲状腺癌细胞株K1采用含青霉素、链霉素、10%牛胚胎血清的RPMI1640完全培养基培养，将其置于37 ℃恒温且5%CO2培养箱中。用光学显微镜观察K1细胞株的生长状况，并根据其生长状态来确定更换培养基的时间，24～48 h更换一次培养基。待K1细胞贴壁生长至培养瓶壁70%面积时传代，用PBS溶液轻轻冲掉脱落的细胞及细胞碎片，重复2～3次，然后加入0.25%胰酶1 mL对细胞进行消化，当细胞形态改变，大致变为圆珠状，并不再附着瓶壁时，加入完全培养基停止消化，吹打均匀后将瓶中带有细胞的培养基分装一半到另一培养瓶中，然后将其放回至培养箱中继续培养，12 h内换液。

1.3 FoxM1.siRNA至人甲状腺癌细胞株K1的转染严格按照上述消化细胞的步骤，用1×106/mL的细胞密度，将消化下来的细胞种植于6孔板中，待细胞融合度达到70%～80%时进行转染，转染前为避免青链霉素对转染造成影响，24 h前改换不含青链霉素的培养基培养，转染前用PBS溶液将6孔板中的细胞冲洗2次，之后每个孔加入1 mL空白RPMI1640培养基，放入培养箱使其饥饿1 h，同时将5 μL的siRNA和5 μL的LipofectamineTM2000分别加入500 μL的空白RPMI1640培养基中孵育5 min，再将两者混合后静置20 min，之后将其加入先前制备饥饿细胞的6孔板两个孔中，作为转染组；重复上述操作将之前的siRNA替换为control siRNA，加入2个孔作为无意义序列组；剩余2个孔加入PBS作为空白对照组。轻轻晃动6孔板，将液体铺匀孔底，转染6 h后，将孔内液体移除，并加入含有血清的RPMI1640培养基，48 h后在200倍荧光显微镜下观察孔内带有荧光的细胞个数，并记录其占比，如果带有荧光的细胞占比达80%以上，即为转染成功。

1.4FoxM1蛋白表达检测采用免疫印迹试验。①细胞总蛋白提取：用上述步骤消化状态良好且密度达到1×106/mL的细胞,调制成单细胞悬液。用离心机离心5 min，离心速度1 000 r/min。将少许冰敷过的PBS溶液加入离心瓶中，并将细胞吹匀，再次离心，上述操作重复2次。将离心后的上清液去除，200 μL的RIPA裂解工作液加入到离心过的细胞中，之后将其转入EP管进行超声波震碎，持续10 s，重复振荡10次，吹打均匀，冰上冰敷30 min,再用离心机在4 ℃环境下以12 000 r/min离心15 min。取离心后的上清液放入-20 ℃冰柜中保存。②蛋白定量：采用BCA法。具体实验步骤按BCA蛋白定量试剂盒中的说明书进行操作。蛋白定量之后，加入相同体积的2×蛋白上样缓冲液，之后100 ℃变性5 min，然后放入-80 ℃冰柜中封存备用。③电泳及转膜：按照定量结果，计算30 μg蛋白上样的体积，得出结果后进行SDS-PAGE蛋白电泳。根据所测蛋白相对分子质量不同，配置合适浓度的SDS-PAGE胶，按照10%分离胶和5%浓缩胶配置SDS-PAGE胶。将之前准备好的蛋白样品和标记物按顺序加入上样孔中。在浓缩胶与分离胶中分别用80 V与120 V恒压电泳，待不同相对分子质量蛋白均匀分布于分离胶上后停止电泳。然后将目的蛋白相对分子质量所在区域的胶体切下，将PVDF膜置入甲醇中浸泡约5 s，之后用转膜液将其洗净。将已用转膜液泡透的滤纸按由下至上的顺序(滤纸-PVDF膜-所切凝胶-滤纸)放进湿转膜仪器内，90 V恒压转膜1 h。完成后用TBST冲刷掉膜表面的转膜液，之后放入已配置好的含10%脱脂奶粉的封闭液中2 h。④免疫印迹杂交显色。待封闭2 h后，用TBST冲刷膜表面，放入配置好的存有一抗的抗体孵育盒中，用脱色摇床在4 ℃环境下摇动12 h。用TBST将膜冲洗2～3次，每次10 min。放入之前调配好的存有HRP-IgG二抗的抗体孵育盒中，用脱色摇床在37 ℃环境下孵育2 h。按照BeyoECL Star(特超敏ECL化学发光试剂盒)使用说明，上机荧光显色。Image J软件分析所测免疫荧光条带灰度值。相关蛋白表达量计算=(所测蛋白灰度值/内参灰度值)×100%。

1.5细胞增殖抑制率测算采用MTT法。按上述将FoxM1的siRNA转染至人甲状腺癌细胞株K1的步骤，将细胞分为3组，并将细胞消化下去，并调制成单细胞悬液，以1×104/mL的细胞密度将细胞均匀种于96孔板中，四周的孔内加入等体积PBS。将分组后的每组细胞设置6个副孔，之后将其分为24、48、72 h组，并在每组时间点的前4 h加入20 μL的MTT药剂进行培育，使之形成甲赞蓝，之后在每组各自的时间点，将孔内液体移除，每个小孔中加入150 μL的DMSO，并振动10 min，酶标仪的波长选择490 nm，以空白孔作为调0孔，用酶标仪测各组每个孔的OD值；对测得的吸光度值删除最大值及最小值，其余数据取平均值；重复以上实验3次。按照公式计算FoxM1-siRNA对细胞增长的抑制率：细胞增殖抑制率=(空白对照组OD490-转染组OD490)/空白对照组OD490×100%。

1.6细胞迁徙能力检测采用单层细胞划痕损伤修复实验进行检测。按上述步骤将细胞分组后，培养于6孔板中，每组取2个复孔，放入培育箱培育。等到细胞基本铺满孔底，形成细胞单层后，用200 μL的枪头在每个孔内做一条划痕，宽度控制在0.6 mm左右，然后使用PBS溶液对每个孔进行冲刷2～3次，冲刷掉脱落的细胞及细胞残片，弃培养基，加入空白的RPMI1640培养基，并进行记录，记为0 h，之后每24 h拍照记录1次，直到72 h。观察0、24、48、72 h照片中划痕的面积变化。

1.7肿瘤细胞体外侵袭能力检测实验前将准备好的Matrigel胶放入4 ℃冰箱中12 h，之后将Matrigel胶和空白RPMI1640按1∶9比例配液，取20 μL配好的Matrigel胶均匀铺在Transwell小室上，滴加Matrigel胶时注意不要产生气泡，之后将Transwell盒放入培育箱12 h使Matrigel胶凝固，按上述实验将分好组的细胞培育48 h后消化下来，以2×105/mL密度100 μL无血清无青链霉素培养基种到小室的上室，将仅含有10%浓度血清的1640培养基600 μL加入到下室；随后移入培育箱中培育18 h；之后用PBS溶液冲刷小室3次，清除上室表层的细胞，用4%甲醛浸泡30 min；取出小室，再次用PBS溶液冲洗，并自然风干；之后在小孔中添加结晶紫染色15～20 min，用蒸馏水冲洗干净；将聚碳酸酯膜从小室上切下来并放到载玻片上，当其风干后，用中性树胶滴在切片中央并用盖玻片盖上干燥；用200倍光学显微镜观察穿过聚碳酸酯膜的细胞，随机观察15个视野，并记录穿过的细胞数量，计算其平均值，然后进行对比，实验重复3次。

2　 结果

2.1各组FoxM1蛋白相对表达量比较空白对照组、无意义序列组、转染组FoxM1蛋白相对表达量分别为0.96±0.01、0.95±0.01、0.27±0.03，转染组与空白对照组、无意义序列组比较，P均<0.05；空白对照组与无意义序列组比较，P>0.05。

2.2各组细胞增殖率比较见表1。转染组细胞生长均受到抑制，与无意义序列组、空白对照组比较，P均<0.05；无意义序列组与空白对照组比较，P>0.05。

表1　三组不同时点细胞增殖率比较

注：与转染组相比，*P<0.05。

2.3各组细胞迁徙能力比较24 h后，空白对照组、无意义序列组、转染组划痕面积相对比值分别为0.83±0.01、0.82±0.01、0.93±0.01，转染组与空白对照组、无意义序列组比较，P均<0.05；空白对照组与无意义序列组比较，P>0.05。

2.4各组肿瘤细胞体外侵袭能力比较空白对照组、无意义序列组、转染组穿过上小室背面的细胞数分别为(92.40±3.05)、(85.40±5.13)、(37.20±3.96)个/视野，转染组与空白对照组、无意义序列组比较，P均<0.05;空白对照组与无意义序列组比较，P>0.05。

3　讨论

甲状腺癌在发展中国家的发病率虽然不高，仅占所有恶性肿瘤的1%，但其在内分泌系统肿瘤中常见，目前甲状腺癌在我国的发病率排在所有肿瘤疾病的第10位，其中甲状腺乳头状癌最常见，占所有类型甲状腺癌的70%左右，且发病率日益增加[5]。甲状腺乳头状癌恶性程度并不高且生长相对较慢，易出现淋巴结转移。手术是治疗甲状腺癌的首要方式，但因其解剖结构复杂，血供丰富，再加上其内分泌的作用，致使术后并发症多[6]。术后10年生存率较高[7]，但其复发率亦很高，后果是伴随病死率的升高。因此寻求新的靶向治疗药物已成为研究和治疗甲状腺癌亟待解决的问题。

正常人体细胞有增殖、凋亡生理过程，而肿瘤细胞的增殖及凋亡均出现异常状态。研究[8]发现，FoxM1基因异常表达可能致肿瘤细胞增殖及凋亡改变。FoxM1可调控部分相关代谢过程，使肿瘤细胞增殖、能量代谢保持平衡，不仅如此，FoxM1还参与肿瘤细胞凋亡、转移等相关进程的调控，与肿瘤细胞的转移、血管形成和上皮-间质转化等关系密切[9，10]，FoxM1表达异常与肿瘤患者的临床分型差、预后差有明显相关性。国内关于FoxM1在甲状腺癌中表达意义的研究相对较少，且多通过组织水平实验[11]证明FoxM1过表达对甲状腺癌增殖等生物学行为有促进作用。

FoxM1属于Forkhead的转录因子家族中的一员，其主要功能是调节细胞G1期的过渡，从而调节细胞有丝分裂，所以FoxM1只在具有丝分裂功能的细胞中表达，且FoxM1在细胞增殖周期中起重要作用[12,13]。FoxM1位于染色体12p13.3的末端着丝粒区域，其长度约为25 kb，FoxM1主要功能是增强细胞和组织的增殖，在胎儿组织中表达更广泛。如果FoxM1的一些功能缺失，导致其过度表达，则会导致细胞增殖等一系列生物学行为紊乱，阻碍细胞分化，导致细胞恶变。本研究结果显示，空白对照组、无意义序列组、转染组FoxM1蛋白相对表达量、细胞增殖率、穿过上小室背面的细胞数低于空白对照组、无意义序列组，划痕面积相对比值高于空白对照组、无意义序列组，差异均有统计学意义，证实沉默FoxM1可抑制人甲状腺乳头状癌K1细胞株增殖，降低细胞侵袭及迁徙能力，FoxM1有望成为甲状腺乳头状癌新的靶向治疗基因。

参考文献：

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