Vero细胞培养A/Shanghai/02/2013（H7N9）Va流感病毒适宜条件研究

非成瑞，马磊，高菁霞，崔兆海，宋绍辉，李卫东，廖国阳

中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所，云南 昆明650118

流感病毒目前仍是人类健康的重大威胁之一[1-3]。H7N9 流感病毒自2013年以来，在我国共计发生5 次人群感染暴发疫情，截至2017年8月7日，感染病例1557 例，其中605 人死亡，病死率高达38.86%[3]。疫苗接种是对抗流感病毒感染和传播的最有效方法。20 世纪40年代以来，鸡胚生产人用流感疫苗的方法已成功使用了数十年[4-5]。然而，当面临流感大流行或生产针对高致病性甲型流感病毒的疫苗时，鸡胚的生产能力有限，并且卵清蛋白的存在会引起过敏反应[6]。相比之下，基于细胞培养的生产系统可以更快速地生产疫苗，更容易扩大规模，不会引起过敏反应，并且有研究表明与MDCK 细胞和鸡胚相比，在Vero 细胞中培养的甲型流感病毒血凝素蛋白（hemagglu⁃tinin，HA）糖基化方式与在人呼吸道上皮细胞分离出的流感病毒更接近，用Vero 细胞培养的流感疫苗可能能更好地介导人体产生对流感的免疫应答[7]，该细胞系的安全性已得到充分证实[8]，世卫组织建议将Vero 细胞作为流感疫苗生产的替代基质，这也是流感大流行应急储备的一项重要内容。在本研究中，我们用Vero 细胞作为培养基质，培养反向遗传学技术重组获得的H7N9 病毒株，对其培养条件进行优化后连续传代15 代得到Vero 细胞适应的H7N9 高产株，并对细胞工厂进行大规模培养条件优化，病毒产量稳定，可实现大规模生产。

1 材料与方法

1.1 材料

143 代Vero 细胞来源于美国ATCC；甲型流感病毒Vero 细胞适应株A/Shanghai/02/2013（H7N9）Va，是由H3N2 流感病毒Vero 细胞适应株的6 个基因片段（PB1、PB2、PA、NP、M、NS）与H7N9 的2 个基因片段（HA、NA）重配获得，该重配毒株的减毒特性已在动物实验中得到证实[9]。细胞和毒株均由中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所生物制品五室保存。

DMEM/F12 培养基购自Gibco 公司；MEM 基础培养基和PBS 由中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所溶液组提供；TPCK 胰酶购自Worthington 公司；牛血清白蛋白（BSA）购自北京索莱宝科技有限公司；细胞工厂购自赛默飞世尔科技有限公司；流感病毒吸附液（DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合，添加不同量的碳酸氢钠和TPCK 胰蛋白酶）、维持液［DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合，添加0.3 mg/mL BSA、1%谷氨酰胺和0.5%双抗（10 kU/mL 青霉素+10 mg/mL 链霉素）为基本成分，添加不同量的碳酸氢钠和TPCK 胰蛋白酶等］由云南省重大传染病疫苗研发重点实验室制备。

1.2 病毒培养条件的优化

采用单一变量法，分别对病毒接种MOI、培养温度、pH 值和TPCK 胰酶等毒株培养条件进行优化。向基本成分中加入不同浓度的TPCK 胰酶，分别配制病毒吸附液和维持液。T225 细胞培养瓶中长成致密单层的Vero 细胞经0.125%的胰蛋白酶消化后传代至T25 瓶中，置37℃培养48 h；细胞长满致密单层后用PBS 洗3 次，因为细胞培养液中血清类淀粉蛋白P 会抑制甲型流感病毒表面唾液酰化糖蛋白的活性，影响病毒的产量[10]，根据不同条件接种H7N9 型重配流感病毒，置37℃培养吸附1 h；加入病毒维持液后于33℃继续培养72 h 后收集培养液，3000r/min 离心20 min，收集上清液，测定血凝滴度[11]。

1.3 病毒在Vero细胞中的连续传代培养

Vero细胞生长至对数生长期后，H7N9病毒用吸附液（DMEM/F12和MEM以1∶1混合，添加1.5μg/mLTPCK胰蛋白酶和NaHCO3至pH值为7.4）以1∶1000稀释后接种Vero细胞，于34℃吸附1h后补加维持液（DMEM/F12和MEM以1∶1混合，添加0.3mg/mLBSA、1%谷氨酰胺、0.5%双抗和1.5μg/mL TPCK胰蛋白酶，添加NaHCO3至pH值为7.4），于34℃继续培养，感染48h后补加TPCK胰酶至1μg/mL，72h后收集培养上清，3000r/min离心20min，收集上清液，测定血凝滴度，冻存于-80℃。所收获的病毒液以1∶1000稀释后继续接种对数生长期的Vero细胞。如此连续传代至第15代。

1.4 测定病毒TCID50

将MDCK 细胞用0.125%胰酶消化后计数，以1.5×104/孔的数量加到96 孔板中，于37℃、0.5%CO2恒温培养箱中培养，24h 后细胞长满致密单层，用病毒稀释液（DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合，添加0.3 mg/mL BSA、1%谷氨酰胺、0.5%双抗和2 μg/mL TPCK 胰酶，并添加NaHCO3至pH 值为7.2～7.6）将病毒进行1/10 梯度稀释，每个稀释度8 个孔，每孔100 μL 病毒稀释液，于34℃、0.5%CO2恒温培养箱中培养72 h，收获病毒感染细胞上清液，测定血凝效价，按Reed-Meunch 法计算病毒感染性滴度（TCID50/mL）。

1.5 细胞工厂大规模培养及工作种子批的制备

按照优化的H7N9 流感病毒培养条件，用细胞工厂培养病毒。细胞工厂规格为10 层托盘，培养面积6320 cm2，培养细胞数量最高可达16 亿，一个细胞工厂的病毒液产量为1.5 L。但是，利用细胞工厂大规模培养病毒时，病毒吸附这一步骤使生产工艺变得繁琐。为简化Vero 细胞大规模生产流感病毒的工序，通过实验对比吸附和不吸附接种病毒，检测病毒收获液的血凝效价，同时接种20 个细胞工厂，其中10 个用以MOI 为0.001 稀释后吸附1 h 再补加维持液接种病毒，其余则将病毒按MOI 为0.001 直接用维持液稀释接种Vero 细胞。同时为制备工作种子批，接种18 个细胞工厂，收获病毒液，6000 r/min 离心15 min 去除细胞碎片，以13 mL/支分装，冻存于-80℃。

1.6 统计学分析

所有实验条件重复3 次，数据采用Graphpad软件分析，以x±s表示各指标水平，组间差异性检验采用方差分析（Ordinary one-way ANOVA），P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒培养条件

在其他条件保持一致情况下，分别以MOI 为0.001、0.01、0.1、1.0 接种病毒，血凝效价统计学结果无显著性差异（图1A），虽然MOI 为1 和0.1 时细胞在50～60 h 全部病变，MOI 为0.01 和0.001 则需要66～72 h，但是在建立毒种时要求毒种能以最小接种量达到最大产量，且大规模生产疫苗时需要在快速生产疫苗的同时节约成本，因此最终确定最佳接种MOI 为0.001。分别在33℃、33.5℃、34℃、34.5℃和35℃下培养H7N9 流感病毒，34℃、34.5℃和35℃的结果显示无显著性差异，均可达到较高的血凝滴度（图1B）。分别以pH 值为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8 和8.0 培养H7N9 病毒，最终得到最佳培养pH 值为7.4（图1C）。由于流感病毒增殖过程中需要TPCK 胰酶使血凝素前体蛋白（hae⁃magluttinin precursor，HA0）裂解为HA1 和HA2 后才具有感染性，在吸附液和维持液中须添加一定量的TPCK 胰酶，并且为了保障新的病毒可以继续复制，需要在病毒培养一段时间后进行补加，但实验证明过多的TPCK 胰酶会对细胞造成损伤，反而会影响病毒的复制。设置TPCK 胰酶添加量分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 μg/mL，并且在48 h 后补加量为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL，最终得到的TPCK 胰酶添加量和病毒培养48 h 后的补加量分别为1.5 μg/mL（图1D）和1.0 μg/mL（图1E）。

综上所述，该重配H7N9 流感病毒的最适培养条件为：以MOI 为0.001 接种病毒，培养液pH 值为7.4，TPCK 胰酶添加量为1.5 μg/mL 时，于34～35℃培养48 h，补加TPCK 胰酶至终浓度为1.0 μg/mL，培养72 h 左右，待细胞完全病变时收获培养液。

2.2 病毒连续传代结果

用优化后的培养条件接种病毒，病毒收获后以1∶1000 稀释，连续传至15 代，检测每一代的血凝效价和病毒感染性滴度。结果表明，病毒的血凝效价和TCID50随着传代代次逐渐提高，血凝效价最高可达512，TCID50最高可达到108.5/mL，并保持相对稳定（图1F）。且病毒感染Vero 细胞后，72 h 内不同时间段均可明显观察到不同程度的细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），直到所有细胞病变脱落（图2）。

2.3 细胞工厂大规模培养及工作种子批的制备

按照优化条件分别对比吸附和不吸附条件，各接种10 个细胞工厂后，收获病毒液检测每一个细胞工厂血凝效价，结果显示病毒不吸附接种可以达到和吸附接种相同的血凝效价和感染性滴度。证明大规模培养时可以简化病毒培养工序而不影响病毒产量。同时，利用该培养系统成功建立了毒种工作种子批，13 mL/支分装量，一支可接种100 个细胞工厂。结果见表1。

图1 不同培养条件下血凝效价结果及连续传代结果

3 讨论

本实验优化了经反向遗传学重配获得的H7N9 型流感毒株在Vero 细胞中的培养条件。Vero 细胞生长至对数期时，细胞致密且状态较好，培养流感病毒后血凝效价最高；而胞龄过大时细胞对流感病毒不敏感，不能引起病毒的有效感染。病毒接种MOI 主要与毒种和病毒感染性滴度有关，若TCID50较低，可能MOI 为0.1 以上才能达到较高的血凝效价[11-12]，而本实验毒株在MOI 分别为1、0.1、0.01 和0.001 时均可达到相同血凝效价，只是病变时间不同。细胞培养流感病毒时，只有添加TPCK 胰酶使HA0 裂解为HA1 和HA2 后病毒才具有感染性，有研究表明培养流感病毒H5N1 时TPCK 胰酶添加量为5 μg/mL[12]，但是本研究证明过多的TPCK 胰酶会对Vero 细胞造成损伤，导致病毒没有足够的宿主细胞来复制，并通过实验得到TPCK 胰酶添加量应为1.5 μg/mL；TPCK 胰酶随着病毒复制会被不断消耗，为了满足病毒新一轮的复制，培养48 h 后应补加TPCK 胰酶至1.0 μg/mL，此时部分细胞已病变脱落，补加TPCK 胰酶过多会对细胞造成更大损伤。连续传代15 代后，病毒产量提高，血凝效价可达512，病毒感染性滴度TCID50最高可达108.5/mL，并维持稳定。扩大至细胞工厂培养可行并且对比吸附接种和不吸附接种无显著性差异，大大简化了细胞工厂大规模培养工艺，同时证明该毒株可以实现细胞工厂大规模培养，且产量稳定，此外，利用该培养系统建立了工作种子批毒种。

综上所述，我们确定了用Vero 细胞培养H7N9 流感病毒的条件，获得高产H7N9 流感病毒的Vero 细胞，并且可以利用该培养系统进行大规模培养生产，成功建立了工作种子批。

图2 高产毒株的细胞病变效应

表1 不同接种方式的血凝效价和感染性滴度