百合鳞片组织培养研究

马生军，丁万红，李淑珍，靳元元，周晋

1.新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐830052；2.新疆农业科学院 综合试验场，新疆 乌鲁木齐830012

百合（Lilium browmiiF.E.Brownvar.viridu⁃lumBaker），为百合科（Liliaceae）百合属草本植物，别名喇叭筒、夜合花、野百合或博多百合等。百合性喜半荫环境，自然生长在海拔300～1000 m的山坡草丛中、疏林下、山沟旁，是百合中既耐寒也耐热的种类之一，产于我国河北、山西、河南、江西、浙江等地[1-4]。适宜栽培在半阴地，具有丰富腐殖质，土层深厚排水良好的轻松沙壤土中。

现代研究发现，百合含有酚酸酐油脂、苷类、生物碱、多糖、微量元素及蛋白质、磷脂、无机元素等多种成分[5-10]，具有止咳、祛痰、平喘、抗癌、降血糖等多种药理作用[10-14]。百合性甘、寒，药用部位为其干燥肉质鳞叶，可用于养阴润肺、清心安神，临床用于治疗阴虚久咳、虚烦惊悸、精神分裂等[15-16]。

百合的繁殖方法很多，有播种、鳞片扦插、小鳞茎繁殖和组织培养等。常规的繁殖方法为小鳞茎培养，但该法繁殖系数低、易感染病毒，不仅不能满足生产上的需求，还容易造成其品质和优良性状的退化，严重影响了百合的品质和经济价值。应用组织培养技术可有效解决以上问题，其不仅繁殖周期短，而且繁殖系数大，有着分生繁殖无法比拟的优势。此外，用组织培养法实现百合的快速繁殖，对保护和合理开发利用百合资源具有非常重要的现实意义。我们采用组织培养法筛选百合繁殖的适宜条件，以期为百合的资源保护和开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

百合植株地下鳞茎来源于新疆乌鲁木齐市明珠花卉市场；6-苄基腺嘌呤（6-BA）、赤霉酸（GA3）、α-萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等生长调节剂购自合肥博美生物科技有限责任公司。FHP-300 种子发芽箱（上海鸿都电子科技有限公司）；哈东联超净工作台（哈尔滨市东联公司）；78-1 型磁力加热搅拌器（金坛市华峰仪器有限公司）；VIC-212 型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；MSL-3750 立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（日本三洋公司）；枪形镊、直镊、手术剪、解剖刀、培养皿、三角瓶（100 mL）。

1.2 无菌环境的建立

接种外植体时，必须保证接种环境的整洁与无菌，以降低污染率。接种前，用75%酒精擦拭超净工作台台面，在超净工作台内放入百合组培苗、无菌器具及用品，紫外线杀菌20 min。

1.3 培养基的配制

分别配制MS、B5、N6培养基的母液，按6.4 g/L琼脂加热融化，30 g/L 蔗糖用水溶解，并分别附加不同种类及浓度的激素。调培养基pH 值为5.8，激素均在灭菌前加入。高压灭菌条件为121℃保持20 min。

1.4 外植体的接种

在超净工作台内，用已在酒精灯上灼烧灭菌的枪形镊将百合组培苗从锥形瓶中取出，置于已灭菌的大号培养皿中的滤纸上，吸干残留水分。选取生长良好的百合鳞片，用直镊和解剖刀切割成适当大小，接入培养基。

1.5 培养基的选择及培养条件

培养基是植物组织培养的基础，不仅能够固定外植体，还能满足外植体生长过程中的需求。

本实验启动培养基为MS、B5、N6，芽的诱导、增殖、壮苗与生根培养基以MS 培养基为主，并添加不同浓度的激素。植物组织培养要求一定的pH 值，本实验培养基pH 值控制为5.8。①启动培养基：以MS、B5、N6培养基为启动培养基，并添加相同浓度的激素6-BA、NAA；②诱导培养基：以MS 培养基为诱导培养基，并添加不同浓度的激素6-BA、NAA；③增殖培养基：以MS 培养基为增殖培养基，并添加不同浓度的激素6-BA、NAA；④壮苗培养基：以MS 培养基为壮苗培养基，并添加不同浓度的激素6-BA、NAA、GA3；⑤生根培养基：以MS 培养基为对照生根培养基，并添加不同浓度的激素IBA。

培养温度26±1℃，光照周期12 h/d，光照强度1200 lx。

2 结果

2.1 不同培养基对百合增殖的影响

培养基是植物组织培养的重要因素。参照刘国民[17-20]等报道的方法，选用长势良好、高度相近的百合芽苗，分别接种于MS、B5、N6培养基上。3 种培养基选取相同浓度的6-BA、NAA 配比，观察统计不同培养基上不定芽的增殖率及长势，结果见表1。接种30 d 后，从生芽苗的增殖倍数及生长情况看，当6-BA 和NAA 的浓度配比一定时，MS 培养基的增殖效果最好，增殖倍数达3.06，苗生长健壮，丛生芽较多，叶色浓绿。B5培养基中丛生芽的增殖倍数相对较低，为2.53，丛生芽也较多，苗生长情况良好。N6培养基中丛生芽的增殖倍数最低，为2.39，苗长势较差，叶色淡绿，丛生芽少。统计结果表明，MS 培养基中丛生芽的增殖倍数和生长情况均优于B5和N6培养基，因此MS 培养基为百合最适增殖培养基（图1）。

2.2 不同浓度的激素配比对百合不定芽诱导分化的影响

细胞分裂素具有刺激细胞分裂、促进细胞生长等作用。细胞分裂素6-BA 主要对植物细胞的分裂以及茎、芽的分化起作用。在组织培养中加入6-BA，目的是刺激细胞分裂和由器官上分化不定芽，以及促进叶片生长、茎长高和抑制根的形成。一般认为6-BA 和NAA 的组合最适于百合鳞片再生芽[21]。

在无菌操作条件下，挑选生长良好、大小相近的百合鳞片接入培养基，观察百合鳞片不定芽的诱导分化情况，结果见表2。接种8 d 后，百合鳞片表面开始出现黄绿色的圆形突起并逐渐分化成芽，接种30 d 后，观察并统计结果。当6-BA的浓度为0.5 和1.0 mg/L 时，随着NAA 浓度的升高，不定芽的诱导率及生长呈下降趋势；当6-BA的浓度为2.0 mg/L 时，不同NAA 浓度条件下的芽诱导率均偏低，表明高浓度的NAA 和6-BA 对不定芽的诱导均有一定的抑制作用。当NAA 浓度为0.5 mg/L 时，随着6-BA 浓度的增加，芽的诱导率呈先上升后下降的趋势；当6-BA 浓度为1.0 mg/L 时，芽的诱导率最高，达62%，苗生长健壮，叶色浓绿。由此可知，百合不定芽诱导分化的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA（图2）。

表1 不同培养基对百合增殖的影响

表2 不同激素的浓度配比对百合不定芽诱导分化的影响

图1 百合的初代培养

图2 百合芽诱导培养

2.3 不同浓度的激素配比对百合丛生芽增殖培养的影响

细胞分裂素6-BA 影响顶端优势的变化和茎芽的分化，可以解除顶端优势促进侧芽的增殖，由于其对细胞分裂的作用，在组织培养中常和生长素NAA 一起使用，相互促进茎芽的增殖及细胞的分裂与生长。在无菌操作条件下，将长势良好的百合芽苗切割成小簇，接种到增殖培养基上，接种30 d 后统计丛生芽增殖倍数及生长情况，结果见表3。当6-BA 浓度为1.0 mg/L 时，NAA 浓度越低，丛生芽增殖效果越好；NAA 浓度为0.1 mg/L时，丛生芽的增殖倍数最高，达3.90，苗健壮，长势良好，叶色浓绿。当NAA 浓度为0.5 mg/L 时，随着6-BA 浓度的降低，丛生芽增殖倍数呈上升趋势；6-BA 浓度为0.5 mg/L 时，丛生芽生长效果良好，增殖倍数达2.75。激素浓度偏低及偏高均不利于丛生芽增殖。由此可知，最佳增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（图3）。

2.4 不同浓度的激素配比对百合组培苗壮苗的影响

GA3广泛存在于植物界中，可以促进茎、叶伸长，破除休眠。低浓度的GA3不仅能促进矮小植株茎节伸长，还能刺激在培养中形成的不定胚正常发育成小植株。在无菌操作条件下，将在增殖培养基中生长健壮的芽苗分割成小簇转接到壮苗培养基中，30 d 后统计组培苗的生长情况，结果见表4。低浓度GA3对组培苗的生长有显著促进作用。在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3培养基上，苗生长健壮，最高株高达4.40 cm，植株高度多为2.5～4.0 cm；在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3培养基上，最高株高为4.60 cm，植株高度多为2.5～3.5 cm，苗长势良好。在加入GA3的2 组组培苗中，植株高度及生长情况均优于未加入GA3的组培苗。由此可知，百合最佳壮苗培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3（图4）。

表3 不同浓度的激素配比对百合丛生芽增殖培养的影响

表4 不同浓度的激素配比对百合组培苗壮苗的影响

图3 百合的增殖培养

图4 百合的壮苗培养

2.5 不同浓度激素配比对百合诱导生根的影响

生长素在植物体中的合成部位是叶原基、嫩叶和发育中的种子，成熟的叶片和根尖也产生生长素。在组织培养中，生长素主要用于诱导刺激细胞分裂和根的分化。IBA 为外源植物激素，促进插枝生根，是生根刺激剂。生根培养基以MS为基本培养基，分别附加不同浓度的IBA。

在无菌操作条件下，挑选生长健壮、长2～3 cm 的百合芽苗接入生根培养基；8～10 d，百合鳞茎基部开始产生白色柱状突起，并逐渐长成白色根系；接种30 d 后百合苗全部生根，结果见表5，较高浓度的IBA 对百合生根促进效果较好。在不加任何激素的MS 培养基上，组培苗平均根数为3.22，平均根长为1.15 cm，最长根长为3.30 cm；在加入IBA 的培养基中，随着IBA 浓度的增加，组培苗的生根数及生根效果呈上升趋势。当IBA 浓度为1.0 mg/L 时，平均根数最多，达4.17，平均根长达1.69 cm，根粗壮，苗长势好。因此，百合最佳生根培养基为MS+1.0 mg/L IBA（图5）。

图5 百合的生根培养

3 讨论

植物生长调节剂种类和浓度是影响植物组织培养最重要的因素，而激素是常见的一类植物生长调节剂，对植物的生长和发育起着非常重要的作用。植物生长调节剂对组培苗生长有一定的调节作用，植物生长发育期间体内激素处于一个动态变化过程。不同植物和品种对生长调节剂的种类和浓度反应不同，选择适宜的激素配比才能达到较好的增殖效果。在植物组织培养过程中，常添加一定浓度的生长素促进生根，但因植物种类不同，对生长素的种类及浓度要求也不尽相同[22]。不同的激素种类和质量浓度对植株不定芽诱导有显著影响，当外植体体内细胞分裂素与生长素积累到一定比例时，才能诱导不定芽的形成[23]。较低浓度的生长素与较高浓度的细胞分裂素有利于诱导出芽，研究认为NAA 和6-BA 的组合效果较好[24-25]。

在百合丛生芽的增殖中，当6-BA 和NAA 的浓度配比为10∶1 时，丛生芽的增殖倍数及增殖效果最好，此结论和张艺萍等[26-27]的结果一致。低浓度的GA3对百合组培苗壮苗促进效果良好，但同时致使百合丛生芽的增殖数略低，表明GA3对百合丛生芽的增殖存在一定的抑制作用。百合生根结果显示，在不加任何激素的MS 培养基和加入IBA 的培养基上均可以诱导出根，而IBA 的加入对生根有促进作用。当IBA 浓度较高为0.1 mg/L 时，促进作用明显。

表5 不同浓度的激素配比对百合诱导生根的影响