植物天冬氨酸蛋白酶的结构与功能

2018-04-10高杉蓝兴国

生物技术通讯 2018年6期

高杉，蓝兴国

东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040

天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinases，APs）（EC3.4.23）是四大类蛋白水解酶之一，广泛存在于多种生物中[1]。APs 在MEROPS 数据库（http://merops.sanger.ac.uk/）中被划分为16 个家族，植物中的APs 主要分布于AA 和AD 族中[2]。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sati⁃vaL.）基因组中，目前分别发现69 和96 个APs 基因[3-4]。近年来，对植物APs 结构与功能的研究表明这些APs 在植物生长发育、胁迫等方面有重要的生物学功能。

1 植物天冬氨酸蛋白酶的结构与分类

植物APs 主要分为3 种类型：A 类为典型的APs，B 类为类珠心（nucellin-like）特异的APs，C类为非典型的APs。典型的植物APs 主要含有N端的信号肽（signal peptide）、前导片段（proseg⁃ment）、ASP 结构域（ASP domain）、植物特有插入片段（plant specific insert，PSI）和C 端结构域（car⁃boxy-terminal）。ASP 结构域包含2 个保守的植物ASP 活性位点，即天冬氨酸-苏氨酸-甘氨酸（DTG）和天冬氨酸-丝氨酸-甘氨酸（DSG）[3]。PSI是植物APs 特有结构域，包括50～100 个氨基酸残基[5]，在APs 成熟过程中被加工并切除[6]。依据是否含有PSI，可将植物典型的APs 分为A1 和A2 两类（表1）。类珠心特异的APs 在蛋白结构上含有N 端的信号肽、ASP 结构域和C 端结构域。与典型植物天冬氨酸蛋白酶相比，类珠心特异的APs不含前导片段和PSI。在拟南芥中，类珠心特异的APs 主要有A41（At1g77480）、A47（At1g44130）、A53（At4g33490）、A46（At1g49050）。非典型的APs被细分为6个亚类（C1、C2、C3、C4、C5 和CX）。C1 亚类含有一个信号肽和一段25～30 个氨基酸残基的前导片段；C2 亚类具有转运肽特征的富丝氨酸蛋白，但其一个非常罕见的特征是缺乏前导片段，蛋白水解活性必须受pH 或通过内源性抑制剂调节；C3 亚类包含长前导片段；C4 亚类特异性具有C 端延伸区段；C5 亚类含有DTS 活性位点而不是DTG 活性位点；非典型的APs 序列中不符合上述描述的组被列入CX 亚类（表1）[7]。

表1 拟南芥天冬氨酸家族基因基本信息

2 植物天冬氨酸蛋白酶的加工机制

目前鉴定的大多数植物APs 都是用前体结构域合成的，随后转化为成熟的双链酶[6]。蛋白水解加工在转位至内质网时切除信号肽、前导片段以及全部或部分去除C 端部分的PSI。前导片段的去除可以通过自动催化过程实现，仅须降低pH值，或者可能需要其他分子的催化作用[8]。植物APs 前体的加工涉及去除前导片段和PSI 结构域，然而每个肽段从前体中除去的机理和顺序不尽相同。第一类是PSI 在前导片段之前被完全移除。刺苞菜蓟（Cynara cardunculusL.）中cardosin A 的前体procardosin A 是相对分子质量为64 000的含有PSI 的前体，在低pH 值条件下PSI 被切割并且可被胃蛋白酶抑制剂A 抑制[9]。第二类是先去除前导片段，然后再切割PSI。大麦天冬氨酸蛋白酶最先进行N 端前导片段的加工，然后再切割PSI[10]。由于体外获得的中间形式和最终产物与体内检测的产物略有不同，可能蛋白质的完全成熟还需要其他蛋白酶的参与[11]。第三类是切除了前导片段和部分PSI。在毕赤酵母中表达重组成熟的cyprosin，首先切除前导片段和大部分PSI，然后通过二硫键把轻链和重链结合在一起[12]。此外，毕赤酵母中重组progaline B 的活化须首先部分去除存在于植物APs 中的PSI，将前体蛋白切割成2 条多肽链，随后去除前导片段[13]。

3 植物天冬氨酸蛋白酶的功能

通过对植物APs 遗传突变体的表型分析，结合对APs 的生理生化方面的研究，已发现植物APs 在植物生物胁迫、非生物胁迫、种子萌发、有性生殖及植物衰老等方面具有重要作用。

3.1 生物胁迫

植物在生长发育过程中会受到病原菌的生物胁迫，APs 在这过程中发挥着重要作用。编码拟南芥天冬氨酸蛋白酶A62（AT1g92290）的组成型抗病性基因CDR1，其过表达导致矮化病和对毒性丁香假单胞菌的抗性；反义CDR1植物对病原体的抵抗力减弱，比野生型更易受病原菌株的影响，由此证明该基因可能与病原菌种的抵抗相关[14]。编码拟南芥A46（At1g49050）的APCB1参与BAG6介导的基础抗性，靶向失活天冬氨酸蛋白酶APCB1基因导致抗病性丧失[15]。编码水稻天冬氨酸蛋白酶的基因OsCDR1（OsAP5）在过表达转基因植物中表现为相关防御基因增加与细菌真菌病原体抗性的增强，证明其参与水杨酸介导的抗病性[16]。用稻瘟病真菌（Magnaporthe oryzae）、叶枯病菌（Xanthomonas or orzazae pv.oryzae）或黄瓜花叶病毒（CMV）感染，水稻维管组织中的OsAP77表达明显增强，认为水稻OsAP77基因参与了生物胁迫机制[17]。此外，在马铃薯中也鉴定出响应生物胁迫的APs。马铃薯天冬氨酸蛋白酶StAsp 在致病疫霉感染后的叶片中累积，StAsp 表达水平与马铃薯栽培种对致病疫霉的抗性程度正相关[18]。把马铃薯天冬氨酸蛋白酶StAP-PSI 转化拟南芥植株，显著增强拟南芥对灰葡萄孢菌感染的抗性。StAP-PSI 被分泌到叶质外体中并直接作用于病原体，从而补充植物先天性免疫反应[19]。

3.2 非生物胁迫

编码拟南芥天冬氨酸蛋白酶A5（At3g18490）的ASPG1（Aspartic Protease In Guard Cell 1）参与非生物胁迫反应。过度表达ASPG1导致保卫细胞中脱落酸（ABA）敏感性增加，减少植物中水的损失，可以赋予拟南芥抗旱性[20]。用水杨酸（SA）、异烟酸（INA）、过氧化氢（H2O2）和ABA 处理水稻，OsAP77在维管组织中的表达增加[17]。普通大豆（Phaseolus vulgaris）叶片中天冬氨酸蛋白酶前体PvAP1 的表达受水分胁迫的严格调控[21]。耐寒菠萝（Ananas comosus）中的天冬氨酸蛋白酶AcAP1，在采摘后冷却处理条件下表现出前体基因表达的上调，而易感性表现出采摘后冷却处理的下调，表明AcAP1 与收割后低温胁迫下抗黑心病的发展呈正相关[22]。这些研究结果说明植物APs 参与了植物的非生物胁迫反应。

3.3 种子萌发

拟南芥2S 白蛋白（albumin）是一种液泡蛋白，经翻译后加工形成成熟的2S 白蛋白，植物APs 在此过程中发挥重要作用[23]。蓖麻种子中的APs 在体外能够对2S 白蛋白的前肽（pro2S）进行部分加工。亚细胞定位表明，天冬氨酸内肽酶定位于蓖麻籽成熟胚乳液泡的基质区域，因此认为蓖麻种子的APs 可能参与了pro2S 白蛋白前体的成熟过程[24]。此外，拟南芥的ASPG1参与种子的萌发，突变ASPG1导致种子休眠且种子活力降低，当在无营养培养基上生长时，突变体aspg1-1的幼苗停止发育。因此，ASPG1对种子休眠、种子寿命和种子萌发很重要[25]。水稻OsAp41编码的Oryzasin1在萌发的种子、幼嫩的根和叶中表达量较高，水稻开花后2～4 周，Oryzasin1的表达呈上升趋势，种子形成后其表达量下降，说明Oryzasin1在种子形成过程中发挥重要作用，推测其通过降解储备蛋白以供萌发需要[26]。另外，小麦中的天冬氨酸蛋白酶WAP1和WAP2 可以在体外消化贮藏蛋白谷蛋白，推测其可能参与种子萌发过程[27]。

3.4 有性生殖

天冬氨酸蛋白酶在绒毡层和配子体发育中起重要作用。沉默编码拟南芥A51（At4g12920）的AtUNDEAD的表达，导致绒毡层PCD 出现较早，花粉败育，说明植物APs 对于绒毡层和花粉发育是必需的[28]。水稻OsAP25和OsAP37也参与绒毡层的降解，过表达OsAP25和OsAP37诱导植物和酵母细胞死亡，同时参与转录因子正调节水稻花药中绒毡层细胞的程序性细胞死亡，揭示了APs在水稻生殖发育动态调节中的重要作用[29]。编码拟南芥天冬氨酸蛋白酶A35（At5g02190）的PCS1与胚胎发育和有性生殖有关，PCS1功能丧失突变导致雄性和雌性配子体的变性及发育中胚胎细胞的过度死亡；相反，PCS1过表达通常导致花药开裂处和隔膜处细胞存活，表明PCS1对胚胎发育是必需的[30]。Gao 等[31]描述了新的拟南芥APs A36（At5g36260）和A39（Atlg65240），二者是膜锚定蛋白，与GPI 锚定蛋白COBRA-Like10 共定位于花粉管细胞壁的顶端区域。a36a39突变体显示明显的败育，花粉粒发生类似凋亡的程序性细胞死亡，表明A36 和A39 是参与配子体发生和拟南芥花粉导向的重要因素。水稻OsAP65 蛋白定位于细胞内的囊泡中，其编码基因的缺失导致花粉萌发和花粉管的生长受到抑制，最终导致雄配子体的败育[32]。大麦天冬氨酸蛋白酶基因nucellin则是在发生双受精后进行表达。授粉前nucellin基因仅在靠近合胞体端的胚囊附近的珠心细胞簇中以非常低的水平表达，但授粉后其在整个胚胎周围的大部分珠心细胞中高度表达。nucellin基因表达的时间和空间模式与珠心细胞同步，推测nucellin与珠心细胞死亡有关[33]。

3.5 植物衰老

随着植物茎、叶、种子等器官的衰老，表现为生长速率的下降，如光合速率下降、核酸和蛋白质含量下降、线粒体体积减小导致呼吸速率下降、激素水平变化等。在植物衰老过程中，APs 主要参与光合作用关键酶的降解、激素调控及细胞器降解等过程。烟草CND41 是一种在叶绿体中表达的与DNA 结合的天冬氨酸蛋白酶，它通过降解二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco），在叶片老化中发挥重要作用[34]。马铃薯SPAP1 是一种功能性典型的天冬氨酸蛋白酶，参与乙烯利介导叶片的衰老。SPAP1 促进的叶片衰老及其活性很可能与PSI 结构域无关[35]。天冬氨酸蛋白酶在白杨（Pop⁃ulus tremula）的幼叶中表达很少，但在衰老叶片中的表达量明显升高，可能与细胞中叶绿体的降解紧密相关[36]。在豇豆（Vigna unguiculataL.Walp.）中通过基因组文库筛选分离天冬氨酸蛋白酶基因，发现豇豆APs 在叶和茎中积累但在根中不积累，在衰老的叶片中转录物累积增加，表明该酶可能参与叶片衰老过程[37]。