神经生长因子对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的修复和保护作用

刘宏伟　孟　岩　金　凤

(佳木斯大学第一附属医院，黑龙江　佳木斯　154007)

视神经是由视网膜最内层神经节细胞的部分轴突汇聚形成，当视神经受到损伤后，视网膜神经节细胞的数目会发生进行性减少，从而导致视功能的下降，这种不可逆的视功能损害严重危害了人类的健康〔1〕。视网膜缺血-再灌注损伤(RIRI)是临床眼科常见的一种疾病，可以损伤视网膜神经节细胞及内核层细胞，这一过程有多种因素参与〔2〕。神经生长因子(NGF)是神经营养因子家族中的一员，是感觉神经元存活的必需因子〔3〕。在发育期大鼠视网膜神经节细胞上存在NGF的特异性受体，不同的受体对NGF的亲和力也不同〔4〕。NGF在神经元的生长、发育和分化方面及其再生和功能性表达等多个方面发挥关键作用，还能减少细胞凋亡的发生，但目前NGF对细胞保护的具体作用机制仍不清楚。本研究拟通过大鼠视网膜缺血-再灌注模型探讨NGF对RIRI的保护作用。

1　材料与方法

1.1实验动物实验用健康无眼疾的SPF级Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重200～250 g，购自哈尔滨医科大学实验动物学部〔SCXK(黑)2013-001〕；实验前在佳木斯大学实验动物中心进行适应性饲养。正常饲养，正常光照。

1.2实验试剂水合氯醛购自天根生化科技有限公司；NGF、酒精、甲醛溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)购自北京赛驰生物科技有限公司；SABC免疫组化试剂盒、c-fos和c-jun多克隆抗体均购自武汉博士德生物技术有限公司；其他实验所用试剂均为分析纯。

1.3实验方法

1.3.1实验动物分组及给药将40只SPF级健康成年Wistar大鼠随机分为4组，分别为正常组、模型组、NGF 500 BU组和NGF 1 000 BU组，每组10只，雌雄各半。腹腔内注射戊巴比妥钠0.04 g/kg(20 g/L)麻醉，眼内滴入2滴1%盐酸丁卡因角膜表面麻醉，治疗组大鼠的右眼分别注射NGF 500 BU/眼和1 000 BU/眼；正常组和模型组大鼠左右眼、治疗组大鼠左眼注射同体积生理盐水；每天1次，连续4 d，第2 ～4次给药前用乙醚轻麻。于首次给药30 min后模型组和治疗组大鼠进行视网膜缺血-再灌注造模。

1.3.2视网膜缺血-再灌注模型制备参照已有试验方法〔5〕，选用一次性4号针头自角膜缘刺入大鼠右眼前房，避开血管丛，针头连接生理盐水进行灌注，升高眼压至16 kPa，灌流60 min后抽出针头，轻压角膜缘放出房水，眼压恢复正常，出现血流再灌注；同时随着眼压下降，眼球变软，视网膜充血，瞳孔出现红光反射；滴加抗生素眼药后放回饲养笼。术后第2天观察大鼠的反应，无术眼感染，角膜浑浊，晶状体混浊，瞳孔对光反射存在，则实验动物建模成功。

1.3.3取材及组织固定于实验第5天时将各实验组大鼠断头处死，摘取眼球后置于生理盐水中冲洗，后置于1%戊二醛和10%甲醛混合溶液中固定，后将眼球自上而下纵切至瞳孔中央，再向内、外各成120°夹角切成三等分，然后在鼻侧、颞侧、下侧各纵行切取一条组织，制成蜡块〔6〕，留存备用。

1.3.4相关指标计算通过显微镜观察记录视网膜神经部九层总厚度(简称视网膜厚度)、视网膜厚度比(损伤眼/正常眼)、内核层厚度、内核层厚度比(损伤眼/正常眼)。以正常对照眼(左眼)的神经节细胞计数为100%，计算损伤眼(右眼)正常神经节细胞、变性神经节细胞与坏死神经节细胞所占的百分率。

1.4统计学方法采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2　结　果

2.1NGF对缺血大鼠视网膜萎缩的影响对照组大鼠右眼在发生缺血-再灌注损伤后5 d时，可见明显的视网膜萎缩变化，具体表现为视网膜厚度比减少(P<0.01)，内核层变薄(P<0.05)。然而，经过NGF治疗后，大鼠右眼缺血-再灌注损伤得到明显修复(P<0.01)。治疗组NGF 1 000 BU组大鼠右眼视网膜厚度比和内核层厚度比与正常组比较接近，但仍明显低于正常组，见表1。

2.2NGF对大鼠视网膜神经节细胞缺血坏死的保护作用模型组大鼠右眼在发生缺血-再灌注损伤后5 d时，神经节细胞发生明显变性坏死，正常神经节细胞计数显著减少(P<0.05)。与模型组比较，治疗组大鼠视网膜神经节变性和坏死的情况得到明显修复(P<0.01)，见表2。

表1　NGF对缺血大鼠视网膜萎缩的影响

与模型组比较:1)P<0.01;与正常组比较:2)P<0.05,3)P<0.01，下表同

表2　NGF对缺血大鼠视网膜神经节细胞的影响及其病变分布

3　讨　论

RIRI在临床上是一种常见的病理生理过程，比如视网膜动脉阻塞、青光眼等疾病均可造成RIRI〔7,8〕。这一过程会严重损伤视网膜的结构和功能，使视网膜出现萎缩、内核层变薄的病理变化，同时还可以引起神经节细胞的变性和坏死，严重影响患者的生存质量。NGF是一种蛋白质，是神经营养因子家族中的一员，是感觉神经元存活的必需因子〔3〕，在发育期大鼠视网膜神经节细胞上存在NGF的特异性受体，存在高亲和力和低亲和力之分〔4〕。NGF在神经元的生长、发育和分化方面及其再生和功能性表达等方面发挥关键作用，还能减少细胞凋亡的发生，但目前NGF对细胞保护的具体作用机制仍不清楚。

研究发现，NGF可以通过刺激视网膜血管内皮细胞的生长和增殖，促进视神经处血管管腔的形成，从而促进新生血管的形成〔9〕。Tanaka 等〔10〕研究发现大鼠主动脉内皮细胞可以主动分泌和释放NGF，进一步确认了体内NGF的产生与血管内皮细胞密切相关。此外，Lad等〔11〕研究还发现血管内皮细胞产生并释放NGF时，体内还会出现NGF的高亲和受体TrkA和低亲和受体P75NTR的分泌和释放，从而起到促进体内NGF充分利用，进一步促进视网膜血供的恢复，修复视神经的损伤。Myung-Jin等〔12〕研究发现NGF可促进人脐静脉血管内皮细胞和人皮肤微血管内皮细胞体外增殖和迁移，表现出剂量效应关系，这一研究进一步说明了NGF具有促进内皮细胞增殖和促进血管生长的作用。牛膺筠等〔7〕研究显示，缺血再灌注损伤24 h后视网膜神经节细胞数量明显减少。本研究提示NGF具有防止缺血损伤引起的视网膜萎缩的效果；另外，内核层主要由双极细胞构成，眼睛缺血损伤可明显导致内核层变薄，提示双极细胞数量明显减少，本研究显示NGF能够有效对抗这一损伤，并表现出对双极细胞生长和增殖的促进作用。由于视神经节细胞对缺血造成的损伤极为敏感，并占节细胞层细胞数的90%以上，在缺血-再灌注这一病理过程中会出现变性和坏死表现，本研究提示NGF对视神经节细胞由于缺血造成的损伤具有较强修复和保护作用。

1王栋,刘子瑞,刘宏伟,等.CNTF与NGF对视神经损伤模型大鼠视网膜神经节细胞的影响〔J〕.黑龙江医药科学,2014;37(6):61-2,65.

2Perlman JI,Mccole SM,Pulluru P,etal.Disturbances in the distribution of neurotransmitters in the rat retina after ischemia〔J〕.Curr Eye Res,1996;15:589-96.

3Levi-Montalcini R，Hamburger V.A diffusible agent of mouse sarcoma producing hyperplasia of sympathetic ganglia and hyperneurotization of viscera in the chick embryo〔J〕.J Exp Zool,1953;123:233-87.

4Zanellato A,Comell MC,Dal TR,etal.Developing rat retinal ganglion cells express the functional NGF receptor p140trka〔J〕.Dev Biol,1993;159(1):105.

5Roy J,Blazar BR,Ochs L.The tissue expression of cytokine in human acute cutaneous graft-versus-host disease〔J〕.Transplantation,1995;60:343-8.

6王军志,饶着明,吴勇杰.神经生长因子对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用〔J〕.中国生物制品学杂志,1998;11(2):107-9.

7牛膺筠,赵颖,贾新国,等.视网膜缺血再灌注损伤后HSP70、NF-KB的表达和细胞凋亡的关系〔J〕.眼科研究,2005;23(4):377-9.

8Ozbay D,Ozden S,Muftuoglu S,etal.Protective effect of ischemic preconditioning on retinal ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Can J Ophthalmol,2004;39(7):727-32.

9王丁丁,于强,陈子林,等.神经生长因子对人视网膜血管内皮细胞的影响〔J〕.中山大学学报(医学科学版),2010;31(1):45-9.

10Tanaka A,Wakita U,Kambe N,etal.An autocrine function of nerve growth factor for cell cycle regulation of vascular endothelial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2004;313(4):1009-14.

11Lad SP,Peterson DA,Bradshaw RA,etal.Individual and combined effects of TrkA and p75NTR nerve growth factor (NGF) receptors:a role for the high affnity receptor site〔J〕.J Biol Chem,2003;278(27):24808-17.

12Myung-Jin P,Hee-Jin K,Hyung-Chahn L,etal.Nerve growth factor induces endothelial cell invasion and cord formation by promoting matrix metalloproteinase-2 expression through the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and AP-2 transcription factor〔J〕.J Biol Chem,2007;282(42):30485-96.