紫外分光光度法测定桃金娘果油脂中熊果酸的含量

2018-04-04黄璇莹黄启红吴庆晖彭焱辉罗锦霞

山东化工 2018年5期

黄璇莹，黄启红，吴庆晖，彭焱辉，罗锦霞，林　晨

(中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州　510070)

桃金娘，别名山捻子(拉丁学名Rhodomyrtus tomentosa )，属灌木，高1～2 m；嫩枝有灰白色柔毛。叶对生，革质，叶片椭圆形或倒卵形，长3～8 cm，宽1～4 cm，先端圆或钝，常微凹入，有时稍尖，基部阔楔形，上面初时有毛，以后变无毛，发亮，下面有灰色茸毛，离基三出脉，直达先端且相结合，边脉离边缘3～4 mm，中脉有侧脉4～6对，网脉明显；叶柄长4～7 mm。花有长梗，常单生，紫红色，直径2～4 cm；萼管倒卵形，长6 mm，有灰茸毛，萼裂片5，近圆形，长4～5 mm，宿存；花瓣5，倒卵，形，长1.3～2 cm；雄蕊红色，长7～8 mm；子房下位，3室，花柱长1 cm。浆果卵状壶形，长1.5～2 cm，宽1～1.5 cm，熟时紫黑色；种子每室2列。花期4～5月[1]。桃金娘果具有补血，滋养，安胎。用于贫血，病后体虚，神经衰弱，耳鸣，遗精[2]。

桃金娘利用价值高，其根、叶、果实都能作为药用，桃金娘的果实是一种优质的果酒资源，含有丰富的多糖，根含有酚类、鞣制等保健功效成分[3-6]。熊娟等[7]对桃金娘根中五环三萜类物质做过分析，含有丰富的三萜类物质。熊果酸作为典型的五环三萜类物质，在通常的保健功效成分检验中常作为五环三萜类物质以熊果酸计，桃金娘油具备很高的医学价值，目前对桃金娘油中三萜类物质研究资料较少，现对桃金娘果实中油脂的熊果酸含量进行研究，为其提供更多保健功效做理论依据。

1　材料与仪器

1.1　主要材料

桃金娘果实分别购于广东肇庆、广东韶关、广西桂林、云南、江西、贵州，将购买的桃金娘果实洗净、晾晒、粉碎、过筛后，在105℃烘干至恒重，干燥器内保存备用。

熊果酸标准样品:中国食品检定研究院，冰醋酸、香草醛、高氯酸、石油醚、无水乙醇等均为分析纯，实验室用水为去离子水。

1.2　主要仪器

UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司，电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司，电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司，超声波清洗器： Fisher Scientific，脂肪测定仪SOX406：济南海能仪器股份有限公司，比色管。

2　实验方法

2.1　桃金娘果实中油脂的提取

取于干燥箱中干燥两小时的桃金娘果实粉末，用定量滤纸包裹好置于索氏抽提仪中，于铝杯中加入石油醚适量，设定提取温度65℃，提取时间6 h，回收提取液挥干，得到桃金娘果油脂。

2.2　桃金娘果油脂中熊果酸的提取

准确称取桃金娘果油脂样品0.1 g于100 mL容量瓶中，加入无水乙醇80 mL，超声提取1 h。室温冷却后，用无水乙醇定容至刻度线，摇匀，作为供试液。

2.3　标准储备液的制备

称取0.01 g熊果酸对照品，置100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成约10 μg/mL的熊果酸对照品储备液。

2.4　测定波长的选择

取配置好的标准溶液0.6 mL于比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸轻轻振荡，于60 ℃水浴加热25min，取出冷却后加入5 mL乙酸后，在可见光区进行扫描，如图1确定最大吸收波长546 nm。

图1　熊果酸标准溶液的光吸收曲线

2.5　显色剂香草醛乙酸溶液用量的选择

分别取0.6 mL标准储备溶液加入到6个比色管中，水浴蒸干，分别加入0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸轻轻振荡，于60℃水浴加热25min，取出冷却后加入5 mL乙酸后，在546 nm测定其吸光度值。

图2　显色剂用量对吸光度影响

由图2比较得知，显色剂用量在0.3mL时，吸光度最大，因此选择0.3 mL香草醛溶液用量为显色剂用量。

2.6　稳定剂高氯酸用量的选择

分别取0.6 mL标准储备溶液加入到8个比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8 mL高氯酸轻轻振荡，于60℃水浴加热25min，取出冷却后加入5 mL乙酸后，在546 nm测定其吸光度值。

图3　稳定剂用量对吸光度影响

由图3比较得知，稳定剂在1.2 mL时，吸光度最大，因此选择高氯酸用量为1.2 mL作为稳定剂用量。

2.7　水浴时间的选择

分别取0.6 mL标准储备溶液加入到6个比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸轻轻振荡，于60℃水浴加热5,10,15,20,25，30,35min，取出冷却后加入5 mL乙酸后，在546 nm测定其吸光度值。

图4　水浴时间对吸光度影响

由图4比较得知，稳定时间在25min时，吸光度最大，因此选择25min为水浴时间。

2.8　水浴温度的选择

分别取0.6 mL标准储备溶液加入到7个比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸轻轻振荡，分别于50,55,60,65,70,75,80℃水浴加热25min，取出冷却后加入5 mL乙酸后，在546 nm测定其吸光度值。

图5　水浴温度对吸光度影响

由图5比较得知，吸光度随着水浴温度的升高而增大，但是同比温度下做空白试验，结果显示在水浴温度高于60℃后颜色较深，吸光度较大，因此选择60℃水浴温度为较佳。

2.9　标准曲线的制定

分别取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mL标准储备溶液到比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛乙酸溶液和1.2 mL高氯酸后，于60℃水浴加热25min，取出冷却至室温后加入5 mL乙酸，在546 nm测定吸光度。分析结果见表1。以质量c为横坐标，吸光度值A为纵坐标，进行线性拟合， c与A之间呈线性关系。线性回归方程和线性相关系数见表1，线性拟合曲线见图6。该分析方法线性关系良好，可以进行定量分析。

表1　熊果酸标准溶液的线性回归方程和线性相关系数

图6熊果酸标准溶液线性拟合曲线

Fig.6Linear fitting curve of ursolic acid standard solution

2.10　精密性试验

取配置好的标准溶液0.6 mL于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸轻轻振荡，于60℃水浴加热25min，取出冷却后加入5 mL高氯酸后，在546 nm下测定吸光度。以上操作分别在不同日期，不同人员，不同仪器的情况下分别测试两次，计算六个测定结果的相对标准偏差(RSD)。结果见表2，RSD=1.65%，精密性良好。

表2　测定方法的精密性

2.11　稳定性试验

取配置好的标准溶液0.6 mL于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸轻轻振荡，于60℃水浴加热25min，取出冷却后加入5 mL高氯酸后，分别稳定10、20、30、40、50、60min后，在546 nm下测定吸光度。

标准试样在不同稳定时间点的吸光度如表3，结果显示在60min内基本稳定，RSD=1.1%，具有较好的稳定性。

表3　测定方法的稳定性

2.12　重复性试验

取6个配置好的标准溶液0.6 mL于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸轻轻振荡，于60℃水浴加热25min，取出冷却后加入5 mL高氯酸后，在546 nm下测定吸光度。计算六个测定结果的相对标准偏差(RSD)，结果见表4，RSD=0.9%,具有良好的重复性。

表4　测定方法的重复性

2.13　加标回收率

称取经2.1处理的试样液体0.1 g(精确到0.0001 g)，共称取12个，每四个为一组一共三组，每组保留一个不加标，另外三个进行加标回收实验，样品称取后，按2.2操作处理，于样品中分别加入样品含量的80%，100%，150%的熊果酸对照品，按2.9项下试验方法处理进行比色测定，即进行三组不同浓度的加标回收实验，具体实验数据见表5。从表5可知，此三组不同浓度的平均加标回收率分别为98.8%、98.5%、98.9%，满足一般检测方法对回收率要求。

表5　回收率实验结果

3　样品含量测定

分别取采自6个不同地方的桃金娘果实，按2.1操作计算出桃金娘果含油率，按2.2方法进行供试夜制备，各取0.1 mL供试液于具塞比色管，水浴蒸干，加入0.3 mL5%香草醛乙酸溶液和1.2 mL高氯酸后，于60℃水浴加热25min，取出冷却至室温后加入5 mL乙酸，在546 nm测定吸光度。通过线性回归方程计算得到供试液中熊果酸的含量如表6。